Estratificação do Risco na resposta à radiação ionizante na Síndrome Hereditária para cancro da mama e do ovário associada aos genes BRCA1 e BRCA2

Abstract

Introdução: Os indivíduos portadores de mutação nos genes BRCA1 e BRCA2, que codificam para a SCHMO, são conhecidos por se associarem a um maior risco de desenvolvimento de neoplasias do que a população em geral. De facto, estes indivíduos são seguidos em programas de rastreio rigorosos que utilizam métodos complementares de diagnóstico com radiação ionizante. Apesar do benefício indiscutível destes exames, têm sido levantadas algumas questões relativamente ao seu benefício em pessoas com suscetibilidade genética para o desenvolvimento de neoplasias. Assim, este estudo surgiu com o objetivo de contribuir para o esclarecimento acerca do aumento do risco neoplásico quando estes indivíduos são expostos à radiação ionizante usada nos exames de rastreio. Materiais e Métodos: Colheu-se uma amostra de sangue periférico de indivíduos portadores e não portadores de variantes causais da SHCMO com mutação no gene BRCA2. Após a colheita, algumas amostras foram submetidas a uma mamografia e as restantes a TC lombar. De seguida, avaliou-se a viabilidade celular recorrendo ao ensaio do FMCA às 24h e às 72h após a irradiação, realizou-se a análise do stresse oxidativo avaliando as ROS com recurso as sondas DHE e DCF, e as defesas antioxidantes, utilizando a sonda alaranjando de mercúrio. Avaliou-se ainda a genotoxicidade às 2h e 4h após a irradiação através do ensaio dos micronúcleos. Resultados: No ensaio de FMCA, não houve diferenças de viabilidade entre grupos (portadores e não portadores) ou entre doses de exposição diferentes (mamografia e TC) e a mediana dos valores de viabilidade celular foi cerca de 100%. Acerca da produção de ROS, observou-se que quando comparadas as concentrações de peróxidos intracelulares para o grupo de portadores e o grupo de não portadores das amostras que tinham sido sujeitas a TC, obtiveram-se diferenças com significado estatístico. Todavia, não observarmos diferenças com significado estatístico para mais nenhuma comparação, ou seja, entre grupos (portadores e não portadores) para a dose de mamografia ou entre diferentes doses de exposição, seja para a outra espécie reativa ou para a defesa antioxidante. Por fim, não foi possível avaliar a genotoxicidade porque não foi possível obter células binucleadas suficientes com citoplasma bem definido que nos permitissem realizar a contagem dos micronúcleos.Discussão: Estes resultados contrariam os resultados esperados, nomeadamente em relação às amostras submetidas a TC, que foram irradiadas com uma dose elevada e, por isso, seria expectável que se observasse uma menor viabilidade e um aumento das espécies reativas de oxigénio. Em ambos os protocolos de florescência (FMCA e ROS) seria interessante fazer as respetivas avaliações com recurso a citometria de fluxo porque a fluorescência faz uma medição total da amostra e não célula a célula. Em relação ao ensaio dos micronúcleos, não foram obtidas células com citoplasma definido porque as lâminas poderiam não estar totalmente secas aquando da coloração com Giemsa. Conclusão: No presente trabalho e tendo em conta as condições estudadas não conseguimos provar que existe um aumento da radiossensibilidade de portadores de mutação no gene BRCA2, pelo que são sugeridas alterações ao protocolo nomeadamente em relação ao estudo do efeito da dose cumulativa, como é o caso da imortalização de uma linha de linfócitos portadores da mutação fundadora portuguesa. o que poderá condicionar os resultados.

Introduction: BRCA1 and BRCA2 mutation carriers are known to have a higher risk of developing cancer than the general population. Indeed, these individuals are followed in screening programs that use diagnostic imaging exams with ionizing radiation. Despite the benefit of these exams, some questions have been raised regarding their benefit in people with genetic susceptibility to the development of neoplasms. Therefore, this study emerged with the aim of contributing to the clarification of whether there is an increased neoplastic risk in these individuals due to the ionizing radiation used in the screening exams.Methods: A peripheral blood sample was collected from carriers and non-carriers of causal variants of SCHMO with mutation in the BRCA2 gene. After collection, some samples were submitted to mammography and the rest to lumbar CT. The cell viability was measured using the FMCA assay at 24h and 72h after irradiation, the oxidative stress measured through the evaluation of the ROS using DHE and DCF probes and the antioxidant defenses using the orange mercury probe at 2h and 4h after the irradiation. The genotoxicity was measured at 72h after the irradiation using the micronucleus assay.Results: In the FMCA assay, there was no viability differences between the groups (carriers and no carriers) or between different exposure doses (mammography and TC) and the median cell viability values were about 100%. Concerning ROS production, it was observed that when comparing the intracellular peroxide concentrations for the group of carriers and the group of non-carriers that had been subjected to CT, differences with statistical significance were obtained. However, we did not observe statistically significant differences for any further comparison, that is, between groups (carriers and non-carriers) for the mammography dose or between different exposure doses, either for the other reactive species or for the antioxidant defense. Finally, it was not possible to measure genotoxicity because it was not possible to obtain enough binucleated cells with well-defined cytoplasm to allow us to perform the micronucleus count.Discussion: These results contradict the expected results, namely in relation to the samples submitted to CT, which were irradiated with a high dose and, therefore it would be expected to observe a lower viability and an increase of reactive oxygen species. In both fluorescence assay’s (FMCA and ROS), it would be interesting to perform the measurement using flow cytometry because the fluorescence takes a full measurement of the sample and not cell by cell. In relation to micronucleus assay, cells with defined cytoplasm were not obtained because the slides might not be fully dry when stained with Giemsa.Conclusion: In this work and considering the conditions studied, we were unable to prove that there is an increase in the radiosensitivity of mutation carriers in the BRCA2 gene. Therefore, changes to the protocol are suggested, namely in relation to the study of the effect of the cumulative dose, as is the case of the immortalization of a line of lymphocytes carrying the Portuguese founding mutation which may affect the results.