Molecular Characterization Of Congenital Erythrocytosis And Idiopathic Erythrocytosis Analysed By Next-Generation Sequencing

Abstract

Eritrocitose, ou policitemia, é uma patologia caracterizada por um aumento significativo da massa eritrocitária (>125%), dos níveis de hemoglobina e hematócrito, em relação aos valores de referência, tendo em conta a idade e o sexo. A eritrocitose pode ser congénita (EC) ou adquirida. De acordo com os mecanismos fisiopatológicos e com base nos níveis de eritropoietina (Epo) é classificada como primária ou secundária. A eritrocitose primária é causada por um defeito intrínseco nos precursores dos eritrócitos e, portanto, independente dos níveis de Epo, sendo a forma congénita devida à presença de mutações de ganho de função nos genes EPOR e SH2B3 e a forma adquirida, Policitemia Vera, devida a mutações somáticas no gene JAK2. Estas mutações levam à ativação constante do recetor de eritropoietina após ser estimulado pela Epo. A EC secundária resulta de uma regulação positiva da transcrição do gene da Epo, EPO, a qual pode ser provocada por defeitos nos constituintes da via de deteção de oxigénio, molecularmente caracterizada por mutações nos genes VHL, EPO, EGLN1 e EPAS1, ou com origem em hemoglobinas com alta afinidade para o oxigénio, devido a mutações nos genes globínicos (HBB, HBA1, HBA2) ou nos genes BPGM e PKLR. A eritrocitose secundária adquirida é devida a patologias ou fatores externos que induzem a hipoxia tecidual, a fatores fisiológicos que induzem a diminuição no volume do plasma sanguíneo ou à presença de tumores que induzem um aumento de produção de Epo. Estão descritos onze genes onde mutações de ganho ou perda de função foram associadas a EC (EPOR, SH2B3, VHL, EPO, EGLN1, EPAS1, HBB, HBA1, HBA2, BPGM e PKLR). No entanto aproximadamente 60% dos pacientes continua sem uma etiologia molecular identificada, sendo designados como portadores de eritrocitose idiopática (EI). Estudos de Sequenciação de Nova Geração (NGS) são fundamentais para a identificação novas mutações nos genes já descritos ou em genes candidatos, que possam esclarecer a origem da patologia.Métodos: Neste estudo foram analisadas 77 amostras de indivíduos com EI, acompanhados na Unidade de Eritropatologia e Metabolismo do Ferro, do Laboratório de Hematologia Molecular - Centro Hospitalar e Universitário de Coimbra. Os testes de laboratório foram orientados pela história clínica e familiar e pelos níveis de Epo, usando a sequenciação Sanger e NGS, com um painel de genes dedicados à EC, para encontrar mutações patogénicas que justifiquem o fenótipo apresentado.Resultados e Discussão: O estudo realizado permitiu a identificação de mutações em 28 dos 77 indivíduos estudados. Em 5 pacientes, foram detetadas mutações patogénicas que já estavam descritas como associadas a EC, nos genes SH2B3, HBB e VHL, Em 15 pacientes foram detetadas 13 variantes novas nos genes EPOR, JAK2, SH2B3, EGLN1, EPAS1, EPO, PKLR e VHL. Em 8 pacientes encontramos 6 novas variantes em genes candidatos, EGLN2, EGLN3, HIF1α, HIF3α e PIEZO1. O grau de patogenicidade das variantes encontradas foi avaliado pelo uso de ferramentas in silico. Das 19 variantes analisadas: 6 foram classificadas como Patogénicas, 1 como Provável Patogénica e 4 como Variantes de Significado Indeterminado. Das restantes, 7 variantes foram classificadas como Benignas ou Prováveis Benignas e 1 variante encontrada num intrão do gene VHL não foi classificada pelo estudo com as ferramentas in silico. As ferramentas in silico escolhidas são específicas para avaliação de alterações exónicas.Conclusão e Perspectivas Futuras: Este estudo permitiu a identificação de variantes patogénicas em 5 dos indivíduos estudados. Em 18 indivíduos foram detectadas variantes classificadas pelas ferramentas in silico como provavelmente patogénicas ou de significado indeterminado. Será necessário confirmar a patogenicidade destas variantes com estudos familiares e funcionais. A verificar-se serem variantes patogénicas, o estudo realizado permitiu a identificação da causa molecular responsável pela EC em 37% das amostras estudadas. Estudos de sequenciação completa do exoma ou do genoma serão necessários para identificar novos genes que possam estar associados a EC e permitirem o diagnóstico dos restantes indivíduos que permanecem como IE.

Erythrocytosis or polycythemia is a pathology characterized by a significant increase in erythrocyte mass (>125%) as well as an increase in hemoglobin and hematocrit levels to reference values according to age and sex. Erythrocytosis can be congenital (CE) or acquired. According to pathophysiological mechanisms and based on the levels of erythropoietin (Epo), they can be classified as primary or secondary. Primary erythrocytosis is caused by an intrinsic defect in the erythroid precursors and, therefore, independent of Epo levels, the congenital form is molecularly characterized by mutations in the EPOR and SH2B3 genes and the acquired form, Polycythemia Vera, by somatic mutations in JAK2 gene. Mutations in these genes lead to constant activation of the erythropoietin receptor after being stimulated by Epo. Secondary CE results from up-regulation of EPO transcription, which can be caused by defects in the components of the oxygen-sensing pathway, molecularly characterized by mutations in the VHL, EPO, EGLN1, and EPAS1, or with origin in hemoglobin with high oxygen affinity, due to mutations in the globin genes (HBB, HBA1, HBA2), or in the BPGM and PKLR. Secondary acquired erythrocytosis results from external factors that induce tissue hypoxia, by a physiological factor that causes a decrease in blood plasma volume, or by tumors that induce higher Epo production. Eleven genes are described where gain- or loss-of-function mutations were associated with CE (EPOR, SH2B3, VHL, EPO, EGLN1, EPAS1, HBB, HBA1, HBA2, BPGM e PKLR). However, approximately 60% of patients still do not have an identified molecular etiology, being designated as having idiopathic erythrocytosis (IE). Next-Generation Sequencing (NGS) studies are essential to identify new mutations in genes already described or in candidate genes that can clarify the origin of the pathology.Design and Methodology: In this study, 77 samples of patients with IE, followed up at the Unidade de Eritropatologia e Metabolismo do Ferro, do Laboratório de Hematologia Molecular - Centro Hospitalar e Universitário de Coimbra, were analysed. Laboratory tests were guided by clinical and family history and Epo levels, using NGS and Sanger sequencing, with a NGS panel of genes dedicated to erythrocytosis to find pathogenic variations which justify the presented phenotype.Results and Discussion: The study carried out allowed the identification of mutations in 28 of the 77 individuals studied. In 5 patients, pathogenic mutations that were already described as associated with CE were detected in the SH2B3, HBB, and VHL genes. In 15 patients, 13 new variants in EPOR, JAK2, SH2B3, EGLN1, EPAS1, EPO, PKLR, and VHL genes were detected. In 8 patients we found 6 new variants in candidate genes, EGLN2, EGLN3, HIF1α, HIF3α and PIEZO1. The degree of pathogenicity of the variants found was evaluated using in silico tools. Of the 19 variants analysed: 6 were classified as Pathogenic, 1 as Likely Pathogenic and 4 as Variants of Uncertain Significance. The remaining 7 variants were classified as Benign or Likely Benign. 1 variant found in one intron of the VHL gene was not classified by the study with the in silico tools. The chosen in silico tools are specific for evaluating exon variants.Conclusion: This study allowed the identification of pathogenic variants in 5 of the individuals studied. In 18 individuals, variants classified by the in silico tools as probably pathogenic or of undetermined significance were detected. It will be necessary to confirm the pathogenicity of these variants with family and functional studies. When verifying that they are pathogenic variants, the study carried out allowed the identification of the molecular cause responsible for CE in 37% of the samples studied. Complete exome or genome sequencing studies will be needed to identify new genes that may be associated with EC and allow diagnosis of the individuals who remain as IE.