Molecular Insights into the Role of FoxN1 in Thymic Epithelial Cell Development and Function: Generation of a platform for T-cell development through FoxN1-induced cell reprogramming

Abstract

The development of T cells, essential mediators of adaptive immune responses towards infectious agents and cancer cells, is orchestrated in the thymus, a process known as thymopoiesis. Importantly, thymopoiesis is not a cell-autonomous process. In this regard, the thymus holds an epithelial framework composed by cortical (cTEC) and medullary (mTEC) thymic epithelial cells that educate each step of the differentiation of T-cell progenitors into functionally competent and self-tolerant T cells. Despite their non-redundant roles in the thymopoietic process and distinct anatomical position within the thymus, cTECs and mTECs arise from the same bipotent thymic epithelial progenitor cells (TEPCs). Bipotent TEPCs are the main accountable for the patterning of the thymus into cortical and medullary domains during embryogenesis and renew the thymic epithelium throughout ontogeny. Yet, the nature and kinetics of embryonic and postnatal and adult TEPCs are poorly understood. Through the establishment of clonogenic assays that selectively support the growth and expansion of epithelial stem cells, our group has reported that mouse TECs with clonogenic potential preferentially reside in the cTEC compartment at a postnatal stage. Interestingly, cells that emerged from these clonogenic TECs, referred to as clonoTECs, lacked cTEC/mTEC traits, but expressed epithelial stem cell markers. Furthermore, clonoTECs lose the expression of Forkhead box N1 (FoxN1), a transcription factor indispensable for the entry of TEPCs into the TEC differentiation program and their downstream maturation. Thus, we postulate that clonoTECs revert to a TEC progenitor stage due to a failure in activating and maintaining FoxN1 expression. In this thesis, by integrating TEC clonogenic assays and a conditional FoxN1 knock-in mouse model (iFoxN1), we demonstrated that enforced constitutive expression of FoxN1 in iFoxN1-derived clonoTECs, termed iclonoTECs, promoted their differentiation into the cTEC lineage. Although this was not transversal to all iclonoTEC, depriving iclonoTECs of hydrocortisone, cholera toxin and epidermal growth factor, commonly employed to improve the colony forming efficiency and expansion of epithelial stem cells, augmented the representation of reprogrammed iclonoTECs by selectively impairing the homeostasis of non-reprogrammed iclonoTECs. Additionally, iclonoTEC reprogramming was further potentiated through the parallel activation of the Wnt, but not FGF, BMP or RA signalling pathways. Lastly, we illustrated the functional competence of reprogrammed clonoTECs in promoting early stages of T-cell development in vitro, namely progression of double negative thymocytes to the double positive stage. Collectively, our findings demonstrate that FoxN1-induced clonoTECs could represent a reliable platform to promote future studies on the early events of TEC differentiation and T-cell development.

O desenvolvimento de células T, mediadores essenciais de respostas imunes adaptativas contra agentes infeciosos e células tumorais, é orquestrado no timo. Este processo, vulgarmente referido como timopoiese, não é uma propriedade autónoma. Neste sentido, o timo possui uma matriz composta por células epiteliais do cortéx (cTECs) e medula (mTECs) que educam cada estágio da diferenciação de progenitores hematopoiéticos em células T funcionais e auto-tolerantes. Apesar de possuírem papeis distintos no processo timopoiético e da diferente localização anatómica dentro do timo, tanto cTECs como mTECs derivam dos mesmos progenitores bipotentes de células epiteliais do timo (TEPCs). Estes progenitores são os principais responsáveis pela organização do timo em domínios corticais e medulares, e rejuvenescem o epitélio tímico ao longo da ontogenia. Contudo, a identidade de e dinâmica de TEPCs no estágio de desenvolvimento embrionário e adulto estão pouco caraterizadas. Através de ensaios clonogénicos que suportam a expansão de células epiteliais estaminais, o nosso grupo descreveu recentemente que TECs com propriedades clonogénicas residem preferencialmente no córtex tímico durante o desenvolvimento pós-natal. Células que emergiram de TECs com potencial clonogénico, denominadas de clonoTECs, eram desprovidas de características que definem cTECs e mTECs, mas expressavam marcadores de células estaminais epiteliais. Além disso, clonoTECs perderam progressivamente a expressão da proteína Forkhead box N1 (FoxN1), um fator de transcrição indispensável para a diferenciação de TECs a partir de TEPCs. Consequentemente, hipotetizámos que clonoTECs reverteram a um estágio de desenvolvimento primordial devido a uma incapacidade de ativar e/ou manter a expressão de FoxN1.Nesta tese, através da combinação de ensaios clonogénicos com um modelo transgénico condicional de murganho para o FoxN1, nós demonstrámos que forçar a expressão de FoxN1 em clonoTECs derivadas do iFoxN1 (iclonoTECs) promoveu a sua entrada num programa de diferenciação enviesado para a linhagem cortical. Apesar de isto não ter sido transversal a todas as iclonoTECs, a remoção de hidrocortisona, da toxina da cólera e do fator de crescimento epitelial, comummente suplementados para amplificar a eficiência de formação de colónias e a expansão de células epiteliais estaminais, aumentou a representatividade de iclonoTECs reprogramadas ao inibir seletivamente a homeostase de iclonoTECs não reprogramadas. Adicionalmente, a reprogramação de iclonoTECs foi potenciada através da ativação paralela de vias de sinalização do Wnt, mas não FGF, BMP ou RA. Por último, ilustrámos a competência de clonoTECs diferenciadas em promover eventos iniciais do desenvolvimento de células T in vitro, nomeadamente a progressão de timócitos duplos negativos para o estágio duplo positivo. Coletivamente, nós estabelecemos clonoTECs induzidas com FoxN1 como uma plataforma que poderá permitir realizar futuros estudos nos eventos iniciais da diferenciação de TECs e do desenvolvimento de células T.