The role of micronutrients in the DNA damage response - The case of zinc in acute myeloid leukemia

Abstract

A integridade genómica é assegurada por várias moléculas que trabalham conjuntamente para erradicar ou minimizar a lesão do DNA. Estas constituem a resposta à lesão do DNA (DDR). Vários micronutrientes atuam em reações essenciais da DDR, sendo a adequada biodisponibilidade destes fatores dietéticos crucial para o seu ótimo funcionamento. O zinco (Zn) é particularmente relevante por estar envolvido em várias funções fundamentais à célula desde a resposta ao stress oxidativo, apoptose, regulação do ciclo celular, do metabolismo, síntese e reparação do DNA. Notavelmente, vários mecanismos de reparação do DNA envolvem o Zn. Apesar do papel do Zn na prevenção da doença ser bem definido, as suas funções na carcinogénese são menos conhecidas. No contexto do sistema hematopoiético, uma adequada DDR é essencial à manutenção das células estaminais hematopoiéticas, evitando a acumulação de lesões nestes precursores. Alterações da DDR têm sido reportadas na leucemia mielóide aguda (LMA) e relacionadas com a origem da doença. Outra observação comum nos doentes com leucemia é o decréscimo sérico de Zn. Apesar da frequência deste achado, o significado biológico do Zn na LMA e a relação com a DDR nas células leucémicas não são bem compreendidos. Este trabalho pretendeu estudar o papel do Zn na modulação da DDR na LMA e explorar o seu potencial como coadjuvante da terapia anticancerígena. Para tal, um modelo celular de LMA (HEL) foi incubado em condições normais de cultura (standard) com o teor basal de zinco presente no soro fetal bovino, bem como em depleção de Zn e em suplementação com ZnSO4 por 2, 7 e 15 dias. As respostas basais e induzidas por exposição de 30 minutos a 10µM de H2O2 e a 60 segundos de radiação ultravioleta (Ee=2.9841 W.cm-2) foram avaliadas a cada momento temporal. Para compreender se os papéis do Zn variam no contexto fisiológico e patológico, uma linha celular de linfócitos humanos normais (IMC) foi submetida às mesmas experiências. A lesão cromossómica, morte celular e níveis de divisão celular foram avaliados pelo teste do micronúcleo com bloqueio da citocinese. A monitorização da yH2AX, biomarcador da lesão e da cinética de reparação, foi feita a cada momento temporal antes da exposição genotóxica, após indução da lesão e 1 hora e 24 horas após exposição. A expressão de genes da DDR (PARP1, XRCC1, MSH2, MSH6, MLH1, XPA, ERCC1, RAD23B, RAD51, PRKDC, XRCC6, PALB2, FANCD2 e MGMT) foi avaliada por qRT-PCR. Para compreender o papel do Zn na modulação de inibidores da DDR e de compostos quimioterapêuticos utilizados na LMA, as células HEL foram incubadas com olaparib e citarabina em monoterapia e combinação com Zn. Os resultados foram analisados estatisticamente considerando um nível de significância de 95% (p <0,05). Comparativamente a standard, a suplementação com Zn diminuiu a lesão basal e a morte celular nos linfócitos normais e aumentou ligeiramente a proliferação. Pelo contrário, nas células de LMA verificou-se aumento da lesão basal ao longo do tempo de suplementação, ligeiro aumento da morte celular e redução dos níveis de divisão celular. Após estímulo genotóxico, os linfócitos suplementados apresentaram uma resposta mais eficiente à lesão do que os da condição standard, manifestado pelo decréscimo da lesão cromossómica, particularmente ao 7º e 15º dia de suplementação, aumento da morte celular e diminuição dos níveis de divisão celular. Por oposição, os linfócitos em depleção de Zn revelaram uma resposta menos eficiente e maior lesão cromossómica. Nas células de LMA suplementadas houve aumento da lesão cromossómica comparativamente às da condição standard, enquanto que os menores níveis de lesão se verificaram na ausência de Zn. A monitorização da yH2AX pareceu corroborar que nos linfócitos suplementados poderá haver reparação, que não é atingida na ausência de Zn, e que na linha de LMA a lesão persiste após exposição genotóxica. A análise da expressão génica não revelou diferenças significativas entre condições, com exceção da diminuição significativa (1.02 vezes inferior, p=0.0315) da expressão basal de XRCC6 nas células HEL suplementadas. Os resultados da monoterapia e da terapia combinada revelaram redução da proliferação e viabilidade celular de forma dependente da dose e do tempo, tendo a terapia combinada apresentado efeitos mais eficazes. Estes foram claramente demonstrados pelo efeito sinérgico do Zn com o olaparib e citarabina na maioria das doses testadas e pelo marcado decréscimo do IC50 do olaparib e da citarabina em combinação com o Zn comparativamente à monoterapia (doses 2,8 vezes e 5,4 vezes inferiores, respetivamente). Em suma, os dados corroboram a importância do Zn na manutenção de respostas adequadas à lesão do DNA no contexto preventivo da doença e a sua possível aplicabilidade como coadjuvante potenciador de terapias genotóxicas ou das que têm como alvo a DDR, revelando um duplo papel do zinco no contexto preventivo e terapêutico do cancro, em particular da LMA.

Genome integrity is assured by a plethora of molecules that work together to eradicate or minimize repair DNA damage. These constitute the DNA damage response (DDR). Many micronutrients are crucial for key DDR reactions, meaning that adequate bioavailability of these dietary factors is critical for optimal DDR functioning. Zinc (Zn) is particularly important for playing pivotal roles in the cell, from oxidative stress responses, to apoptosis, cell cycle regulation, metabolism, DNA synthesis and repair. Notably, many DNA repair mechanisms involve Zn. Despite the role of Zn in disease prevention is well defined, its functions in carcinogenesis are far less explored. In the context of the hematopoietic system, an appropriate DDR is essential for the maintenance of the hematopoietic stem cells’ pool homeostasis, by avoiding the accumulation of DNA damage in these precursors. DDR alterations have been found in acute myeloid leukemia (AML) and related to the leukemogenesis process. Moreover, a common observation in leukemia patients is the decrease in serological Zn. Despite the frequency of this finding, the biological significance of Zn for the leukemogenesis process and relation with the DDR in AML cells is not understood. This work aimed to study the role of Zn in the modulation of the DDR in AML and explore its potential as co-adjuvant in leukemia therapy. To do so, cellular model of AML (HEL) was incubated in standard (Std) culture conditions containing the basal Zn levels presented in fetal bovine serum, in Zn depletion and in supplementation with ZnSO4 for 2, 7 and 15 days. Basal and induced cellular responses to exposure to 10µM of H2O2 for 30 minutes and 60 seconds of UV radiation (Ee=2.9841 W.cm-2) were evaluated at each time point. To understand whether Zn’s roles differ in health and disease, a cell line of normal human lymphocytes (IMC) was submitted to the same experiments. Chromosomal damage, cell death and cell division rates were assessed by the cytokinesis-block micronucleus assay. The monitorization of yH2AX, biomarker of DNA damage and repair kinetics, was performed at all evaluation times before genotoxic exposure, after initial damage induction, and 1 hour and 24 hours following exposure. The expression of DDR genes (PARP1, XRCC1, MSH2, MSH6, MLH1, XPA, ERCC1, RAD23B, RAD51, PRKDC, XRCC6, PALB2, FANCD2 and MGMT) was evaluated by two-step qRT-PCR. To acknowledge the role of Zn in the modulation of DDR inhibitors and chemotherapeutic compounds used in AML, HEL cells were submitted to treatment with olaparib and cytarabine in monotherapy and in combination with Zn. Results were statistically analyzed considering a confidence level of 95% (p<0.05). Comparatively to Std Zn conditions, supplementation reduced basal chromosomal damage and cell death in normal lymphocytes and led to slight increases in proliferation. Oppositely, in AML cells it was observed an increase of basal chromosomal damage through time of supplementation, a slight increase in basal cell death and a decrease in cell division rates. Upon genotoxic exposure, Zn-supplemented lymphocytes demonstrated a more efficient response than those from Std conditions, manifested by the decrease in chromosomal damage, particularly at the 7th and 15th days of supplementation, increase in cell death and decrease of cell division rates. Contrastingly, Zn-depleted lymphocytes shown a less efficient damage response, presenting increased chromosomal damage levels. Supplemented AML cells shown an increase in DNA damage comparatively to those from Std conditions, while the lowest chromosomal damage scores were found in Zn-depletion. The monitorization of yH2AX seemed to corroborate that in supplemented lymphocytes there may be a repair response that is not achieved in Zn absence, and that in the AML cell line damage persists following initial genotoxic exposure. Gene expression analyses did not reveal significant differences between conditions, except for a significant decrease (1.0 fold, p=0.0315) in XRCC6 basal expression in HEL supplemented cells. The results from monotherapy as well as combination therapy revealed a reduction in cellular proliferation and viability in a dose and time dependent manner, with combination therapy displaying more efficient effects. This was clearly demonstrated by the synergistical effect of Zn with olaparib and cytarabine in most of the tested concentrations and the marked decrease in olaparib and cytarabine IC50 when in combination with Zn comparatively to monotherapy (2.8-fold and 5.4-fold decreases, respectively). In sum, the results corroborate the importance of Zn in the maintenance of adequate responses to DNA damage in the context of disease prevention and a possible application of Zn as a co-adjuvant potentiator of the effects of genotoxic or DDR-targeting therapies, revealing a dual role of Zn both in cancer prevention and therapy, particularly in AML.