Hypoadenosinergic pathologies in a rat model of the Willis-Ekbom disease

Abstract

A doença de Willis-Ekbom, também conhecida como síndrome da perna inquieta, é uma doença neurológica caracterizada pelos seus sintomas. Os portadores experienciam uma inquietante necessidade de estar em movimento, mesmo quando se encontram em repouso sendo que, há um agravamento dos sintomas no período noturno. Outro aspeto clínico é o experienciamento de pequenos episódios de despertares durante o sono, que normalmente precedem o início do movimento das pernas. Dado o estado de excitamento, acredita-se que a nível neurofisiológico exista um hiper-excitamento do sistema nervoso, mais concretamente, associado a uma hiperexcitabilidade dos terminais glutamatérgicos no estriado. A condição mais bem estudada e mais associada a WED é a deficiência de ferro que, pode não ser evidente sistemicamente e ocorrer localmente, como no cérebro. Quer a deficiência de ferro (e a anemia consequente) quer a WED são mais prevalentes em mulheres, que sublinha a necessidade de comparar o efeito de deficiência de ferro no estriado de roedores laboratoriais de ambos os generos. O estriado é a principal estrutura de entrada de estímulos excitatórios dos gânglios da base e encontra-se envolvido tanto em processos motores como cognitivos. A neurotransmissão de glutamato é modulada por vários neurotransmissores como o GABA e neuromoduladores como a dopamina, adenosina, opioides, acetilcolina e endocanabinóides. A existência de uma perturbação nestes sistemas de modulação pode levar a uma variedade de doenças neurológicas. Muitos estudos apontam para a existência de alterações a nível do sistema adenosinérgico em pacientes e modelos de BID. Recentemente foi descrito, pelos nossos colaboradores, um estado hipoadenosinérgico causada por um aumento na densidade dos recetores de adenosina do tipo A2A e/ou uma diminuição dos recetores A1. Assim, recorrendo a um modelo animal (foram alvo de estudo ambos machos e fêmeas, de modo a avaliar se existe um fenótipo específico entre géneros) sujeito a uma deficiência de ferro através da comida. Primeiramente, os animais foram sujeitos a testes comportamentais para avaliar a atividade locomotora, ansiedade e memória. Mais tarde, o cérebro foi recolhido e realizou-se a purificação de sinaptossomas do estriado para realizar o objetivo desta tese: avaliar alterações de densidade dos recetores de adenosina, tal como a percentagem de co-localização entre ambos, em terminais gutamatérgicos cortico-estriatais e tálamo-estriatais e, em terminais colinérgicos, recorrendo à técnica de “sinaptometria” de fluxo. Para além destes, também foram avaliadas alterações dos recetores µ-opióides (MOR), uma vez que agonistas do MOR são eficazes no controlo de sintómas sensorimotórios dos pacientes. e canabinóide do tipo 1 (CB1R), o recetor que é capaz de modular o funcionamento tal dos receptores adenosinérgicos como do MOR via heteromerização, tal como a sua percentagem de co-localização.Uma vez que a deficiência de ferro cerebral (DFC) foi induzido no dia 21 pós-natal, ou seja, depois de maioritariamente concluir o desenvolvimento cerebral, já não foram observadas alterações na locomoção e na habituação dos animais com BID no teste “open field”, tal como no comportamento ansioso realizado no “elevated-plus maze”.No entanto, a técnica da sinaptometria de fluxo revelou fortes tendências para uma redução na densidade dos terminais positivos para MOR e um aumento nos terminais equipados com o recetor facilitatório A2A. Tudo junto, observou-se pela primeira vez um disbalanço no controlo inibitório e facilitatório no nível sináptico em terminais nervosos individualmente identificados, que certamente contribuirá ao nosso entendimento sobre o patomecanismo e a farmacoterapia adequada da WED.

Willis-Ekbom's disease, also known as restless leg syndrome, is a neurological disease characterized by an unsettling need of the patients to move their legs and sometimes arms, even when they are at rest. Nocturnal aggravation of symptoms strongly impar sleep quality. It is believed that at the neurophysiological level, there is a hyperarousal of the nervous system, which is associated with a hyperexcitability of the corticostriatal glutamatergic terminals in the striatum. Iron deficiency is as a major comorbidity for WED has been recognized. Iron deficiency may be restricted to the nervous tissue, which is called brain iron deficiency (BID). Both iron deficiency (and consequent anemia) and WED are more prevalent in women, which underlines the need to compare the effect of iron deficiency on the striatum of laboratory rodents of both genders.The striatum is the main input structure for excitatory stimuli from the basal ganglia and is involved in both motor and cognitive processes. Glutamatergic corticostriatal neurotransmission is modulated by several neurotransmitters such as GABA and neuromodulators including dopamine, adenosine, opioids, acetylcholine and endocannabinoids. Impaired neuromodulation at corticostriatal synapses can lead to a variety of neurological diseases. Many studies point to the existence of changes in the adenosinergic system in patients and models of BID. Recently, a hypoadenosinergic state was described by our collaborators, caused by an increase in the density of type A2A adenosine receptors and a decrease in A1 receptor density, or both.Thus, here I studied the possible presynaptic changes in striatal glutamatergic as well as cholinergic nerve terminals, isolated from young adult rats, after completing a four-week diet with iron poor chow (BID rats), or normal chow (controls). Both males and females were studied in order to purported gender-specific phenotypes.First, the animals were subjected to behavioral tests to evaluate locomotor activity, anxiety and memory. Subsequently, the animals were euthanized, and their brains were collected to prepare purified striatal synaptosomes. My aims were to evaluate changes in the density of glutamatergic and cholinergic nerve terminals endowed with adenosine receptors, as well as µ-opioid receptors (MOR) – since MOR agonists are efficacious in controlling patients' sensorimotor symptoms, and finally, cannabinoid CB1 receptors, because it is capable of modulating the functioning of both adenosine receptors and MOR via heteromerization.Since BID was induced on the 21st postnatal day, that is, after that the brain development is largely completed, overt behavioral changes in locomotion, habituation and anxiety-like behaviour of BID rats were not observed in the open field and elevated-plus maze tests. Spatial working memory in the Y-maze spontaneous alternation test also remained intact in the BID rats. However, the technique “flow synaptometry” revealed strong tendencies towards a reduction in the density of MOR-positive terminals and an increase in A2AR-positive terminals. Alltogether, for the first time an imbalance has been documented in inhibitory and facilitatory neuromodulation at the synaptic level in individually identified nerve terminals, which will certainly contribute to our understanding of the pathomechanism and the adequate pharmacotherapy of WED.