Phenotypic characterization of cellular and animal models of Machado-Joseph disease

Abstract

Machado Joseph disease (MJD), or spinocerebellar ataxia type 3, is a neurodegenerative disease caused by a cytosine-adenine-guanine (CAG) trinucleotide expansion in the coding region of the ATXN3 gene, which is translated into the mutant ataxin-3 protein. The mutated protein is prone to misfold and aggregate as neuronal cytoplasmic and intranuclear inclusions, leading to defects in motor neuron activity mainly in the cerebellum, brainstem, and spinocerebellar tracts, which results in progressive impairment of motor coordination in patients. Despite current efforts and advances, MJD remains an incurable fatal disease, with no disease-modifying treatment available, so far. This gap may be explained by the inexistence of consistent and reliable disease models, and consequently, the lack of knowledge of the underlying pathological mechanisms of MJD and reliable tools for pre-clinical therapies development. Thus, the generation of more suitable and accurate disease models is an urgent need. Human-induced pluripotent stem cells (iPSCs) hold great potential for modeling MJD, representing accurate in vitro models of human patient-specific neurons, while providing evidence on the disease’s natural history progression. Moreover, mouse models are consensually preferred for the study of MJD, as they share major anatomical and physiological features of the disease in humans. Among them, YACMJD transgenic mouse model has, integrated in its genome, the full gene of human ATXN3, and thus stands out for better recapitulating protein expression and neurological motor phenotype of MJD. The present study aimed to characterize the phenotype of 1) iPSCs-derived neuronal cultures obtained from MJD patients and control individuals, and 2) the YACMJD transgenic mice model. In this work, several markers of the pathological mechanisms of MJD were analyzed through immunocytochemistry and western blot. Our data demonstrated that iPSCs-derived cells were successfully differentiated into heterogeneous cultures of neural and glial cells, while YACMJD homozygous mice displayed an early progressive neurological deterioration. In summary, the results suggest that both models can be used as powerful tools for a deep understanding of MJD pathogenesis, discovery of disease biomarkers, and pre-clinical studies for the development of effective therapies.

A doença de Machado Joseph (DMJ), ou ataxia espinocerebelosa tipo 3, é uma doença neurodegenerativa causada pela expansão do trinucleótido citosina-adenina-guanina (CAG) na região codificadora do gene ATXN3, que leva à formação da proteína mutada ataxina-3. A proteína mutada tende a adquirir uma conformação incorreta, e agregar-se sob a forma de inclusões neuronais citoplasmáticas e intranucleares, causando uma disfunção na atividade dos neurónios motores, principalmente no cerebelo, tronco cerebral e tratos espinocerebelosos, o que resulta num comprometimento progressivo da coordenação motora nos doentes.Apesar dos esforços e avanços até à data, a DMJ continua a ser uma doença fatal e sem cura, não dispondo de nenhum tratamento. Esta lacuna pode ser explicada devido à falta de modelos de doença consistentes e confiáveis e, consequentemente, à falta de conhecimento dos mecanismos patológicos subjacentes à DMJ, bem como de boas plataformas para o desenvolvimento de estudos pré-clínicos. Assim, a geração de modelos de doença mais adequados e precisos é de urgente necessidade. As células estaminais humanas pluripotentes induzidas (iPSCs) têm um grande potencial para modelar a DMJ, como modelos in vitro de neurónios específicos derivados de doentes humanos, permitindo estudar a progressão da história natural da doença. Além disso, os modelos animais de ratinho são preferidos, de forma consensual, para o estudo da DMJ, pois compartilham as principais características anatómicas e fisiológicas da doença em humanos. Entre eles, o modelo de ratinho transgénico YACMJD tem, integrado em seu genoma, o gene completo da ATXN3 humana e, por este motivo destaca-se por recapitular mais fielmente a expressão da proteína mutada e o fenótipo neurológico motor da DMJ.O presente estudo teve como objetivo caracterizar o fenótipo de 1) culturas neuronais derivadas de iPSCs obtidas de doentes e indivíduos controle, e 2) o modelo de ratinho transgénico YACMJD. Neste trabalho, diversos marcadores de mecanismos patológicos da DMJ foram analisados pelas técnicas de imunocitoquímica e western blot. Os nossos dados demonstraram que as células derivadas de iPSCs foram diferenciadas com sucesso em culturas heterogéneas de células neurais e da glia, enquanto que os ratinhos homozigóticos YACMJD exibem uma deterioração neurológica progressiva precoce.Em suma, os resultados sugerem que ambos os modelos podem ser usados como poderosas ferramentas para a compreensão profunda dos mecanismos de patogénese da DMJ, a descoberta de biomarcadores de doença, e em estudos pré-clínicos para o desenvolvimento de terapias eficazes.