Oral cancer: Exploring the potential of liquid biopsies for diagnosis and follow-up

Abstract

O cancro oral encontra-se entre os 10 cancros mais comuns, com 405,000 novos casos esperados anualmente, a nível mundial. A sua taxa de sobrevivência a cinco anos é de aproximadamente 80% no estadio I, mas desce para 20% no estadio IV. Apesar do progresso na área terapêutica, as suas taxas de incidência e de sobrevivência permanecem preocupantes, principalmente devido ao diagnóstico tardio e a altas taxas de recidiva. As biópsias de tecido continuam a ser o gold standard para o diagnóstico e para a determinação do perfil genético dos tumores. No entanto, para além de não serem de fácil obtenção e de estarem associadas a riscos e a dor para o doente, as biópsias de tecido apenas oferecem uma caracterização momentânea da heterogeneidade tumoral, não consideram a plasticidade fenotípica das células cancerígenas, e não podem ser obtidas repetidamente para a monitorização dos doentes. Dada a necessidade de desenvolver métodos não invasivos para a deteção precoce, o diagnóstico, e a monitorização de doentes oncológicos, as biópsias líquidas surgiram recentemente como uma potencial abordagem na medicina de precisão. As biópsias líquidas consistem na deteção de componentes derivados dos tumores, incluindo DNA tumoral em circulação (do inglês, ctDNA), em biofluidos, como o sangue e a urina, ultrapassando várias limitações impostas pelas biópsias de tecido, uma vez que são minimamente invasivas, fáceis de repetir durante o acompanhamento clínico do doente, e capazes de detetar a heterogeneidade tumoral. No entanto, o impacto clínico das biópsias líquidas no cancro oral ainda é muito limitado quando comparado com outros tipos de cancro, requerendo mais estudos de validação para a sua implementação com sucesso. Deste modo, o principal objetivo deste estudo piloto foi explorar o potencial das biópsias líquidas no diagnóstico e na monitorização de doentes com cancro oral. Em suma, procurámos monitorizar as concentrações de DNA livre em circulação (do inglês, cfDNA) no plasma e na urina durante o acompanhamento clínico de doentes com cancro oral, e avaliar e comparar as caraterísticas mutacionais do ctDNA e dos tecidos tumorais correspondentes por sequenciação de nova geração (do inglês, NGS). Ambas as análises quantitativas e qualitativas do cfDNA foram correlacionadas com as caraterísticas clinicopatológicas dos doentes. Para além disso, como um objetivo secundário, estudámos os perfis genómicos e epigenéticos dos tumores orais pelas técnicas de a-CGH e MS-MLPA. Foi possível obter informações preliminares interessantes relativamente à cinética do cfDNA durante o tratamento dos doentes com cancro oral, nomeadamente, que os níveis de cfDNA no plasma parecem aumentar em resposta ao tratamento. Para além disso, a identificação de mutações específicas do cancro em genes como TP53 e SMAD4 no ctDNA revelou que as biópsias líquidas podem ser uma fonte de informação relativamente ao perfil genético dos tumores e à resposta terapêutica no cancro oral. Adicionalmente, a combinação das técnicas MS-MLPA e a-CGH permitiu encontrar alterações frequentes na variação do número de cópias e na metilação em tumores, e identificar um conjunto de genes associados a vias celulares comumente alteradas na carcinogénese que poderão ter potencial como biomarcadores.

Oral cancer ranks within the top 10 most common cancers, with 405,000 new cases being anticipated each year, worldwide. Its five-year survival rate is approximately 80% in stage I but decreases to 20% in stage IV. Despite the improvements made in the therapeutic area, its incidence and survival rates are still concerning, mainly due to late diagnosis and high rates of recurrence. Tissue biopsies are still the gold standard for diagnosis and for the genetic profiling of tumors. However, besides not being easily obtained and implying risk and pain to the patient, tissue biopsies only provide a snapshot of tumor heterogeneity, do not consider the phenotypic plasticity of cancer cells, and cannot be obtained repeatedly for patient follow-up. Given the need to develop non-invasive tools for early detection, diagnosis and monitoring of cancer patients, liquid biopsies have recently emerged as a potential approach in precision medicine. Liquid biopsies consist in the detection of cancer-derived components, including circulating tumor DNA (ctDNA), in biofluids, such as blood and urine, overcoming many limitations presented by tissue biopsies, since they are minimally invasive, easily repeated during patient follow-up, and able to detect tumoral heterogeneity. However, the clinical impact of liquid biopsies in oral cancer is still very limited when compared to other cancers, requiring further validation studies for its successful implementation. In this sense, the main objective of this pilot study was to explore the potential of liquid biopsies for the diagnosis and monitoring of oral cancer patients. In sum, we aimed to monitor plasma and urine cell-free DNA (cfDNA) concentrations before and during the treatment course of oral cancer patients, and to assess and compare mutational characteristics of ctDNA and corresponding tumor tissues by Next Generation Sequencing (NGS). Both quantitative and qualitative analysis of cfDNA were correlated with the patient’s clinicopathological features. Moreover, as a secondary objective, we aimed to establish the genomic and epigenetic profiles of oral tumor tissues by array-Comparative Genomic Hybridization (a-CGH) and Methylation-Specific Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MS-MLPA). We were able to obtain interesting preliminary data on the kinetics of cfDNA during the treatment course of oral cancer patients, namely that plasma cfDNA levels seem to increase in response to treatment. Moreover, the identification of cancer-specific mutations in genes such as TP53 and SMAD4 in ctDNA revealed that liquid biopsies could be a source of information regarding the tumors’ genetic profile and therapeutic response in oral cancer. Additionally, the combination of the MS-MLPA and a-CGH techniques allowed us to find common CNVs and methylation alterations in oral tumors and to identify a set of genes related to commonly altered cellular pathways in carcinogenesis that could have potential as biomarkers.