Pine Wilt Disease: proteomic insights into Bursaphelenchus xylophilus pathogenicity

Abstract

O nemátode da madeira do pinheiro (NMP), Bursaphelenchus xylophilus, é responsável pela doença da murchidão do pinheiro (DMP) e tem causado sérios danos em florestas de todo o mundo, sendo responsável por elevadas perdas económicas e ecológicas. Dois isolados portugueses (BxPt17AS e BxPt96Mang) e dois isolados japoneses de referência (T4, virulento; C14-5, avirulento), mantidos em culturas do fungo Botrytis cinerea crescido em extrato de malte e agar, foram caracterizados morfológica e molecularmente. A análise morfológica foi realizada utilizando caracteres de diagnóstico específicos: cauda do macho, prega vulvar e términus da cauda da fêmea. A caracterização molecular foi realizada através da reação em cadeia da polimerase das regiões espaçadoras internas transcritas do DNA ribossomal seguida de análise dos polimorfismos de comprimento de fragmentos de restrição (PCR ITS-RFLP) com cinco endonucleases de restrição. A caracterização morfológica e molecular confirmou claramente a identificação dos isolados como pertencentes à espécie B. xylophilus. Nemátodes dos quatro isolados do NMP foram inoculados em plântulas de Pinus pinaster e a taxa de mortalidade do hospedeiro e capacidade de reprodução de cada isolado foram determinadas de forma a avaliar a sua virulência. Os resultados demonstraram que todos os isolados desenvolveram sintomas em P. pinaster, alguns dias após a inoculação. No fim do ensaio, 32 dias após inoculação, três dos isolados causaram 100% de mortalidade das plantas, enquanto o isolado C14-5 causou uma taxa de mortalidade de 80%. Entre os quatro isolados, o isolado português BxPt17AS apresentou maior capacidade reprodutiva em P. pinaster e foi selecionado para os estudos posteriores. Adicionalmente, de forma a avaliar a suscetibilidade de P. pinea à infeção pelo NMP, plântulas foram inoculadas com o isolado BxPt17AS. Após o términus do ensaio, nenhum sintoma da doença foi observado nas plântulas inoculadas. Estes resultados indicam que a espécie P. pinea é menos suscetível à doença que P. pinaster. Para além disso, nemátodes do isolado BxPt17AS foram utilizados para obter e comparar o secretoma de B. xylophilus quando exposto a um estímulo de extrato de pinheiro destes dois hospedeiros com diferentes suscetibilidades à doença. Da análise SWATH-MS, 776 proteínas foram quantificadas em ambos os secretomas. Destas, 501 encontraram-se aumentadas no secretoma de B. xylophilus exposto ao estímulo de P. pinea e 22 aumentadas no secretoma de B. xylophilus sujeito ao estímulo de P. pinaster. A análise funcional das 501 proteínas revelou um enriquecimento de proteínas com atividade de ligação. Das 22 proteínas, as mais representadas foram as peptidases, hidrolases e proteínas com atividade antioxidante. As diferenças encontradas no secretoma evidenciam respostas diferentes do nemátode para superar as defesas de hospedeiros com diferentes suscetibilidades.

The pinewood nematode (PWN), Bursaphelenchus xylophilus, is the causal agent of the pine wilt disease (PWD). It has been causing serious damages to pine forests worldwide, being responsible for high economic and ecological losses. Two Portuguese PWN isolates (BxPt17AS and BxPt96Mang) and two reference PWN Japanese isolates (T4, virulent; C14-5, avirulent), maintained on the fungus Botrytis cinerea cultures grown in Malt Extract Agar medium, were morphologically and molecularly characterised. Morphological analysis was carried out using species-specific diagnostic characters: male tail, vulval flap and tail terminus on female. Molecular characterisation was made using the polymerase chain reaction of the internal transcribed spacer regions followed by restriction fragment length polymorphism (PCR ITS-RFLP) with five restriction endonucleases. The morphological and molecular characterisation confirmed the B. xylophilus identity of the isolates. Nematodes of the four PWN isolates were then inoculated in Pinus pinaster seedlings. Host mortality rate and the reproductive ability of each isolate were determined to assess isolates virulence. All isolates revealed to be pathogenic to P. pinaster seedlings, with symptoms development in a few days after inoculation and high mortality rates. However, while three of the isolates presented 100% host mortality rate, the C14-5 had 80%. From the four isolates, the Portuguese isolate BxPt17AS exhibited the higher reproductive ability in P. pinaster seedlings and was selected for further studies. Pinus pinea seedlings were inoculated with BxPt17AS isolate to evaluate this host susceptibility and no dead seedlings or any symptoms of the disease were observed. Additionally, this isolate was unable to reproduce inside P. pinea seedlings. These results shown that P. pinea is much less susceptible than P. pinaster to PWN infection. Moreover, nematodes from the isolate BxPt17AS were used to obtain and compare the nematode secretome when exposed to pine extract stimuli from these two hosts with different susceptibility. Of the SWATH-MS analysis, 776 different secreted proteins were quantified in both secretomes. From these, 501 were found upregulated in B. xylophilus secretome under P. pinea stimulus and 22 upregulated under P. pinaster stimulus. Functional analyses of the 501 proteins revealed an enrichment of proteins with binding activity. From the 22 proteins, proteins with peptidase, hydrolase and antioxidant activity were the most represented. The differences found in the secretome highlighted the diverse response of the nematode to overcome host defences with different susceptibilities.