Reorganization and dysfunction of GABAergic synapses in in vitro epilepsy

Abstract

O GABA (ácido γ-aminobutírico), é o principal neurotransmissor inibitório presente no Sistema Nervoso Central (SNC) e apresenta um papel importante na regulação da excitabilidade neuronal. As Sinapses GABAérgicas estão presentes maioritariamente nos eixos dendríticos e no soma de neurónios excitatórios e inibitórios. A transmissão GABAérgica é mediada pela ativação de uma família de recetores transmembranares: i) os recetores ionotrópicos de GABA do tipo A (GABAARs), compostos pelas subunidades 2α-, 2β-, e 1γ , que formam um canal iónico heteropentamérico permeável a cloreto; e ii) os recetores metabotrópicos de GABA do tipo B (GABABR), os quais são formados por duas subunidades (GABAB1 e GABAB2). Os GABAARs são muito dinâmicos, e a sua expressão na membrana neuronal é regulada pela sua internalização (maioritariamente nas regiões extra-sinápticas) e ainda pela sua taxa de reciclagem. A estabilização destes recetores nas sinapses inibitórias é controlada pela proteína scaffold gefirina, que promove a sua acumulação na sinapse e limita a difusão lateral, contribuindo desta forma para o controle da força da sinalização GABAérgica. Para além disso, as alterações nos recetores a nível pós-sináptico que ocorrem durante a plasticidade das sinapses inibitórias induzem um reajuste da organização pós-sináptica a nível molecular, até mesmo a um nível de nano escala. Em particular, durante da expressão de potenciação sináptica inibitória de longa duração (iLTP), o aumento dos níveis de gefirina na região pós-sináptica está associado uma fragmentação na distribuição da proteína em nano domínios sub-sinápticos. Esta reorganização na distribuição da gefirina contribui para a estabilização da amplitude das respostas pós-sinápticas inibitórias. Por outro lado, a desorganização e dispersão sinápticas da gefirina estão relacionadas com depressão sináptica inibitória.O défice na expressão de GABAARs funcionais tem sido associado com diversas doenças do SNC, incluindo a epilepsia. A epilepsia é uma condição crónica caracterizada por crises espontâneos recorrentes e afeta cerca de 65 milhões de pessoas a nível mundial. A hiperexcitabilidade é considerada como um factor permissivo para a formação e propagação de crises epiléticas. Crises isoladas ou recorrentes conduzem à desregulação da neurotransmissão GABAérgicas; porém, os mecanismos envolvidos ainda não estão clarificados.Uma das principais estratégias terapêuticas no tratamento da epilepsia consiste na potenciação da neurotransmissão GABAérgica a nível sináptico, através da alteração da expressão e / ou atividade dos receptores GABAA; contudo 30% dos doentes apresentam resistência ao tratamento. Uma possível explicação para esta resistência aos fármacos é o facto de as convulsões induzirem uma internalização progressiva dos GABAARs pós-sinápticos o que promove uma diminuição geral da inibição e consequente desequilíbrio entre a transmissão excitatória e inibitória. Este trabalho teve como objectivo principal contribuir para a elucidação dos mecanismos moleculares envolvidos na desregulação das sinapses GABAérgicas na epilepsia. De forma a mimetizar o SE in vitro, foram incubadas culturas de hipocampo neuronais maturas num tampão sem Mg2+ de modo a promover a actividade neuronal. A reorganização dos aglomerados de gefirina nestas condições foi investigada através de uma técnica de microscopia de depleção de emissão estimulada (STED) em conjunto com análises dos “clusters”. Os resultados obtidos indicaram uma diminuição do tamanho e do número de “clusters” de gefirina, o que sugere uma reorganização após o estímulo em condições que mimetizam o SE. Foram também caracterizadas as alterações a nível funcional nas mesmas condições, usando técnicas de eletrofisiologia - patch-clamp. As correntes espontâneas inibitórias pós-sinápticas (sIPSCs) foram analisadas antes e após incubação na ausência de Mg2+, tendo sido observada uma redução da transmissão GABAérgica (indicada pela diminuição da carga total transferida). No seu conjunto os resultados deste trabalho sugerem que o SE induz alterações morfológicas e funcionais nas sinapses GABAérgicas o que leva a uma diminuição da inibição mediada pelos GABAARs.

GABA (γ-aminobutyric acid), is the major inhibitory neurotransmitter of the Central Nervous System (CNS) and plays an important role in the regulation of neuronal excitability. GABAergic synapses mainly target the dendritic shafts and the soma of both excitatory and inhibitory neurons. GABAergic transmission is mediated by activation of a family of transmembrane receptors: i) the inotropic GABA receptors (GABAA R), composed of at least 2α-, 2β-, and 1γ-subunits which form a heteropentameric ion channel permeable to chloride; and ii) the metabotropic GABA receptors (GABAB R), formed by two subunits (GABAB1 and GABAB2). The GABAARs are very dynamic, and their surface expression is controlled by internalization (mainly in the extrasynaptic compartment), in addition to the recycling rate. The stabilization of these receptors at inhibitory synapses is regulated by the scaffold protein gephyrin, which promotes receptor clustering and limits their lateral diffusion, thereby contributing to the GABAergic signalling strength. Moreover, the postsynaptic changes occurring during plasticity of inhibitory synapses induces rearrangements of postsynaptic molecule organization also at the nanoscale level. In particular, during the expression of inhibitory Long-Term Potentiation (iLTP), the increase of synaptic gephyrin is associated with the fragmentation of gephyrin in subsynaptic nanodomains which stabilize the amplitude of inhibitory postsynaptic responses. On the other side declustering and synaptic dispersion of gephyrin is associated with inhibitory synaptic depression. Deficits in functional expression of GABAARs have been associated with several diseases of the CNS, including epilepsy. This chronic condition is characterized by recurrent unprovoked seizures that affect approximately 65 million people worldwide. Hyper-excitability has been considered a permissive factor for the genesis and propagation of epileptic seizures. Single and recurrent seizures lead to a dysregulation of GABAergic transmission, but the mechanisms involved are not yet fully understood. One of the therapeutic approaches to treat epilepsy is to potentiate GABAergic synaptic transmission by modifying GABA receptor expression and/or activity; however, 30% of the patients are resistant to the treatments. One explanation for pharmaco-resistance is that seizures lead to a progressive internalization of postsynaptic GABAARs and to a consequent downregulation of inhibition, leading to an imbalance between excitation/inhibition transmission. The main goal of this project was to contribute to the elucidation of the molecular mechanisms underlying the dysregulation of GABAergic synapses in epilepsy. To model Status Epilepticus (SE), cultured mature hippocampal neurons were incubated in a medium lacking Mg2+, which induces synchronized bursts of neuronal activity. The rearrangement of gephyrin clusters under the latter conditions was addressed by stimulated emission depletion (STED) microscopy Clustering analysis showed a reduction in size and number of gephyrin clusters, suggesting its shrinkage after incubation under conditions that model SE. Moreover, we characterized functional alterations induced by transient incubation of cultured hippocampal neurons in the absence of Mg2+ using patch-clamp recordings electrophysiology. sIPSCs were analysed before and after incubation under conditions that model SE and the results showed a reduction of the GABAergic transmission (decrease in the total charge transfer). Together, our data suggest that SE induce morphological and functional alterations of GABAergic synapses resulting in impaired GABAARs mediated inhibition.