Influência de grupos amínicos na actividade dos complexos respiratórios mitocondriais

Abstract

As mitocôndrias produzem energia celular na forma de ATP pelo processo de fosforilação oxidativa. A síntese de ATP é inibida por tóxicos que actuam a nível da cadeia respiratória, ou da ATP sintase, bem como por desacopladores da fosforilação oxidativa. O fluorodinitrobenzeno (FDNB) é um composto largamente utilizado como sonda para estudar a influência de certos resíduos de aminoácidos na actividade de enzimas pertencentes a vários sistemas biológicos. Como reage com grupos amínicos, pode interferir com a bioenergética mitocondrial se os referidos grupos influenciarem a actividade catalítica dos complexos respiratórios. Para testar esta hipótese, isolaram-se mitocôndrias de fígado de rato que foram postas a reagir com o FDNB. A actividade dos complexos respiratórios mitocondriais foi diferenciada mediante a utilização de substratos respiratórios e inibidores específicos, de modo a seleccionar o envolvimento dos vários complexos no transporte de electrões do substrato para o oxigénio. Foi estudada a acção do FDNB na actividade da mitocôndria a respirar no estado 3 e no estado 4. Os resultados mostram que os complexos I, II e III foram sensíveis ao FDNB, observando-se uma diminuição na velocidade de consumo de oxigénio de maneira dependente da concentração de FDNB. No entanto, a magnitude de resposta ao FDNB diferiu consoante o complexo que inicia o transporte de electrões através da cadeia respiratória. Assim, o complexo I foi sensível para baixas concentrações de FDNB ( 0,25 mM), enquanto que o complexo II só foi afectado a partir de 0,5 mM de FDNB. Além disso, no primeiro caso, o consumo de oxigénio foi completamente inibido a partir de 0,75 mM de FDNB enquanto que, no segundo, ainda se obteve resposta na presença de 1 mM FDNB. O complexo IV foi insensível ao aminoreagente mesmo para altas concentrações (1,5 mM). A inibição dos complexos respiratórios pelo FDNB foi confirmada observando a actividade respiratória na presença do desacoplador FCCP. O complexo V, ATP sintase, também revelou sensibilidade à sonda para concentrações desta a partir de aproximadamente 0,2 mM, uma vez que se observou inibição do estado 3 em condições de insensibilidade respiratória (complexo IV). A inibição respiratória reflectiu-se no potencial transmembranar, em que o efeito do FDNB se traduziu num decréscimo do potencial eléctrico em função da concentração do aminoreagente. Foi também observado que uma solução de FDNB utilizada alguns dias após a sua preparação em dimetilsulfóxido (DMSO) tinha efeitos diferentes dos acima referidos, tendo-se verificado uma acção desacopladora da fosforilação oxidativa, em que o consumo de oxigénio foi estimulado para baixas concentrações (20 M) da solução de FDNB (armazenada), atingindo um máximo a 60 M. Para concentrações mais elevadas, verificou-se uma diminuição na taxa respiratória, continuando contudo a observar-se o efeito desacoplador nas mitocôndrias. A medição do potencial eléctrico transmembranar corroborou esta conclusão, verificando-se uma queda brusca nos valores deste parâmetro, indicadora de desacoplamento oxidação/fosforilação. Através da análise dos espectros de absorção óptica de soluções de FDNB utilizadas em vários períodos de tempo após a sua solubilização em dimetilsulfóxido, verificámos que, de facto, o FDNB é alterado gradualmente ( 8 dias) até se converter inteiramente no desacoplador dinitrofenol.