The effect of gambogic acid and silibinin in Acute Myeloblastic Leukemia

Abstract

A leucemia mieloblástica aguda (LMA) é uma neoplasia hematológica caracterizada pela proliferação descontrolada de progenitores hematopoiéticos com acumulação na medula óssea. Apesar do desenvolvimento de novas terapêuticas para o tratamento da LMA, este ainda se centra na quimioterapia intensiva com combinação de vários fármacos. Neste sentido, torna-se necessário introduzir novas estratégias terapêuticas. Compostos naturais como o ácido gambógico (GA), extraído da planta Garcinia hanburyi, e a silibinina (SLB), da planta Silybum marianum, têm demonstrado efeito antitumoral em diferentes neoplasias, sendo o seu efeito mediado por indução da apoptose, da diferenciação celular e pela inibição da proliferação. Contudo, o efeito destes dois compostos na LMA ainda não está esclarecido.Este trabalho avaliou o potencial terapêutico do GA e da SLB, em monoterapia e em combinação terapêutica, em modelos in vitro de LMA.Deste modo, as linhas celulares KG-1 e THP-1 foram incubadas na ausência e presença de GA e SLB, em monoterapia (administração única e fracionada) e em combinação terapêutica. A atividade metabólica foi avaliada pelo teste da resazurina. A morte celular foi avaliada por microscopia ótica (coloração May-Grünwald-Giemsa) e citometria de fluxo (CF), através da dupla marcação com Anexina V e 7-AAD. O ciclo celular e a ativação da caspase-3 foram também avaliados por CF. Foi efetuada a análise estatística adequada considerando-se um nível de significância de 95%.Os resultados mostram que o GA e a SLB reduzem a atividade metabólica de forma dependente do tempo de incubação, da dose e da linha celular. Após 48 horas de incubação, o IC50 do GA foi de 338 nM nas KG-1 e 453 nM nas THP-1, enquanto o IC50 da SLB foi de 33 μM e 75 μM nas KG-1 e nas THP-1, respetivamente. A administração fracionada mostrou-se mais eficaz nas células KG-1, enquanto que a terapia combinada apresentou um efeito sinérgico em ambas as linhas celulares. Os compostos em estudo induziram morte celular por apoptose, comprovada por aumento da ativação da caspase-3 e pela análise morfológica. A análise do ciclo celular revelou que a SLB provoca bloqueio do ciclo em G0/G1. Todavia, o GA não apresentou efeito citostático.Concluindo, os nossos resultados sugerem que o ácido gambógico e a silibinina poderão representar potenciais abordagens terapêuticas na leucemia mieloblástica aguda, dependendo de características celulares e/ou do esquema de administração.

Acute myeloblastic leukemia (AML) is a malignant hematological disease characterized by an uncontrolled proliferation with subsequent accumulation of immature myeloid cells in the bone marrow. Despite the development of new therapies for treating AML, the standard treatment relies in intensive chemotherapy with combination of several drugs. Natural compounds such as gambogic acid (GA), extracted from Garcinia hanburyi, and silibinin (SLB), from Silybum marianum, showed an antitumoral effect in many neoplasms, by induction of apoptosis and differentiation as well as proliferation inhibition. However, the effect of these two compounds on AML is still unclear.Therefore, this study aimed to evaluate the therapeutic potential of GA and SLB in in vitro models of AML. With this purpose, we used two in vitro AML models, KG-1 and THP-1 cells, incubated in absence and presence of GA and SLB, in monotherapy (single and daily administration) and in combination therapy. Metabolic activity was evaluated by resazurin assay. Cell death was assessed by optic microscopy (May-Grünwald-Giemsa staining) and flow cytometry (FC), using the Annexin V and 7-AAD double staining. Cell cycle and caspase-3 activation were evaluated by FC. The statistical analysis was performed, considering a significance level of 95%.Results show that GA and SLB decreased the metabolic activity in a time, dose and cell line dependent manner. After 72h of incubation, IC50 of GA was 338 nM in KG-1 cells and 453 nM in THP-1, while IC50 for SLB was 33 μM and 75 μM in KG-1 and THP-1, respectively. Daily administration was more effective in KG-1 cells, whereas combination therapy presented a synergistic effect in both cell lines. The drugs induced cell death by apoptosis, proved by increased caspase-3 activation and morphological analysis. Cell cycle analysis demonstrated that SLB caused cell cycle arrest in G0/G1, while GA had no cytostatic effect.In conclusion, our results suggest that GA and SLB may constitute new potential therapeutic approaches in acute myeloblastic leukemia, depending on cellular characteristics and/or drug administration scheme.