Stage and tissue-specific expression analysis of two miRNAs and their targets during Solanum betaceum Cav. somatic embryogenesis

Abstract

A indução de embriogénese somática (ES) é uma técnica de clonagem que permite a obtenção de embriões a partir de outros tecidos além do embrião zigótico. De maneira a induzir competência embriogénica, os explantes devem ser expostos a auxinas ou outros stresses. Em Solanum betaceum, a etapa de indução irá promover a formação de calos que tanto podem ser embriogénicos (CE) ou não-embriogénicos (CNE) e apenas transferindo massas de CE para um meio de cultura sem auxina e com baixas concentrações de sacarose, os embriões e as plantas se desenvolvem.A via de sinalização das auxinas é portanto essencial para a regulação da ES, e genes como TIR, AFB ou GRF’s são fulcrais em processos de desenvolvimento de plantas mediados por auxinas. MicroRNA’s (miRNA’s) são pequenos RNA’s de cadeia única que funcionam como reguladores pós-transcricionais, reprimindo a expressão por clivagem endonucleotídica. Dois destes miRNA’s são o miR393 e o miR396 que desempenham papéis importantes no crescimento, desenvolvimento e maturação de plantas. Ambos são cruciais na via das auxinas, regulando a expressão dos genes TIR e AFB (miR393) e da família dos GRF’s (miR396).Este estudo visou a analisar a expressão dos miR393 e miR396 e dos seus genes alvo durante o processo de ES em tamarilho (Solanum betaceum Cav.), a partir de embriões zigóticos e folhas. Amostras de RNA total e enriquecidos em smallRNAs foram extraídas de calos embriogénico e não embriogénico assim como de explantes recolhidos durante a indução de ES e durante o processo de desenvolvimento dos embriões somáticos. As amostras de RNA foram convertidas em cDNA por transcrição reversa. O RNA total foi usado para a quantificação dos níveis de expressão dos genes alvo enquanto que as amostras de smallRNAs foram usadas para quantificar a expressão dos miRNAs, por análise de PCR quantitativo.Os resultados mostram que as expressões dos miR393, miR396 e dos seus genes alvo, durante os vários estágios de ES e nos diferentes calos, sugerem a sua modulação durante a ES em tamarilho, onde ambos os miRNA’s compartilham uma forte correlação inversa com os genes alvo correspondentes. Mir393 e miR396 parecem regular negativamente os seus genes alvo durante a indução de ES, sendo que durante o desenvolvimento e germinação dos embriões somáticos, os valores de expressão dos genes alvo aumentam (miR393 - TIR1 e AFB2; miR396 - GRF1 e GRF4).Estes resultados fornecem novos conhecimentos sobre a aquisição de competência embriogénica a partir de diferentes explantes de tamarilho, assim como sobre o modo como essa competência é mantida durante as subculturas de calos e expressa durante o desenvolvimento dos embriões.

Somatic embryogenesis (SE) is a cloning technique that allows the development of embryos from tissues other than the zygotic embryo. In order to induce embryogenic competence, the explants must be exposed to auxins or to other different stresses. In the case of Solanum betaceum, this induction stage will promote the formation of callus that can be embryogenic (EC) or non-embryogenic (NEC) by transferring EC to culture media devoid of auxins and with lower sucrose concentrations, embryos and plantlets develop. Thus, auxin pathway is essential in the regulation of SE, involving genes such as TIR, AFB or GRF’s that play a key role in auxin-mediated plant development processes. MicroRNA’s (miRNA’s) are small, single-stranded RNA’s known to function as post-transcriptional regulators of genes, repressing their expression through endonucleotidic cleavage. Two of those miRNA’s are miR393 and miR396 that play important roles in plant growth, development and maturation. Both are crucial in the auxin pathway, by regulating TIR and AFB genes expression (miR393), and the expression of GRF’s genes (miR396). This study aimed to analyse the expression of miR393 and miR396 and their target genes during tamarillo’s (Solanum betaceum Cav.) SE from zygotic embryos and leaf explants. Total RNA and small RNA’s enriched samples were extracted from embryogenic and non-embryogenic callus as well as from explants collected throughout the SE induction and embryo development processes. RNA samples were reverse transcribed into cDNA. Total RNA was used for the quantification of the expression levels of the target genes whereas the small RNA’s were used for the miRNA’s expression quantification by qPCR analysis.Results show that stage and tissue-specific expressions of miR393 and miR396 and their targets suggest their possible modulation on tamarillo SE where both miRNA’s share a strong inverse correlation with the corresponding target genes. MiR393 and miR396 seem to downregulate their target genes expression values during SE induction, while during somatic embryo development and germination, target genes expression values increased (miR393 - TIR1 and AFB2; miR396 - GRF1 and GRF4). These results provide new insights into embryogenic competence acquisition by tamarillo tissues, as well as how that competence is maintained during callus subcultures and expressed during embryo development.