Mitochondrial characterization in Huntington's Disease fibroblasts and iPSC-derived cells

Abstract

A doença de Huntington é uma doença neurodegenerativa autossómica characterizada pela mutação no gene HTT. A presença de uma extensão anormal da cauda de poliglutaminas no N-terminal da proteína HTT promove a sua agregação e, entre outras consequências, leva à disfunção mitocondrial. Embora este mecanismo celular tenha sido extensamente estudado na patogénese da doença de Huntington, neste trabalho tivemos como objetivo definir alterações na função mitocondrial de células humanas derivadas de portadores de doença de Huntington pré- e sintomáticos versus indivíduos controlo. Curiosamente, fibroblastos derivados de portadores de doença de Huntington pré-sintomáticos demonstraram um aumento geral na função oxidativa mitocondrial, quando comparados com controlos e doentes de Huntington em estadio 3. Níveis elevados de espécies reativas de oxigénio foram também observados em fibroblastos de doença de Huntington, assim como uma diminição no número de cópias mitocondriais em fibroblastos de doentes de Huntington em estadio avançado, quando comparados com com células pré-sintomáticas. Depois de aferir disfunção mitocondrial em fibroblastos de doentes de Huntington, foram reprogramadas duas linhas de células estaminais pluripotentes induzidas, derivadas de fibroblastos controlo e estadio avançado de doença de Huntington, e seguidamente diferenciadas em células estaminais neuronais e neurónios estriatais-like. Ao dia 60 de diferenciação, os progenitores neurais de doença de Huntington demonstraram ter um número superior de células MAP2-positivas, caracterizando um fenótipo neuronal maduro, mostrando no entanto número reduzido de células com fenótipo estriatal, em comparação com células controlo. Adicionalmente, neurónios diferenciados derivados de doentes de Huntington demonstraram ter maturação sináptica diminuída, quando comparados com células controlo. A análise bioenergética de células estaminais neuronais demonstrou que células estaminais neuronais de doentes de Huntington usam preferencialmente a via glicolítica para produzir ATP, em vez da via oxidativa mitocondrial. Adicionalmente, mitocôndrias de células estaminais neuronais de doentes de Huntington foram observadas em maior número mas com morfologia menos complexa, sugerindo um fenótipo mitocondrial imaturo. Em neurónios diferenciados derivados de doentes de Huntington, as mitocôndrias demonstraram ter alterações no movimento, aspeto este demonstrado pela velocidade média reduzida (em ambas as direções, retro- e anterógrada). Em conjunto, estes dados indicam que fibroblastos de doentes de Huntington e as respetivas células derivadas de células estaminais pluripotentes induzidas apresentam alterações na função mitocondrial, biogénese e dinâmica, que, por sua vez, podem ter impacto na diferenciação neuronal estriatal e progressão da doença.

Huntington’s disease (HD) is an autosomal neurodegenerative disease characterized by a mutation in the HTT gene. The presence of an abnormal extended polyglutamine (polyQ) tail at the N-terminal of HTT protein promotes its aggregation and, among other consequences, leads to mitochondrial dysfunction. Although this cellular mechanism has been extensively studied in HD pathogenesis, in this work we aimed to define changes in mitochondrial function occurring in human cells derived from HD pre-symptomatic and symptomatic HD carriers versus control subjects. Interestingly, fibroblasts derived from pre-symptomatic HD carriers exhibited an overall increase in mitochondrial oxidative function, compared to controls and stage 3 HD patients. Enhanced levels of reactive oxygen species (ROS) were also observed in HD fibroblasts, as well as decreased mtDNA copy number in late stage HD fibroblasts, compared to pre-symptomatic cells. After assessing mitochondrial dysfunction in HD fibroblasts, two induced pluripotent stem cell (iPSC) lines, derived from control and stage 3 HD fibroblasts, were reprogrammed and further differentiated into neural stem cells (NSC) and striatal-like neurons (HD_Ne). HD neural progenitor cells (HD_NP) at day 60 exhibited increased number of MAP2 positive cells, characterizing a mature neuronal phenotype, but showed decreased number of cells with striatal-like phenotype, in comparison with control cells. Moreover, HD_Ne showed lower synaptic maturation, when compared to control cells. The bioenergetics analysis in NSC demonstrated that HD NSC use preferentially the glycolytic pathway to produce ATP, instead of the mitochondrial oxidative pathway. Additionally, mitochondria from HD NSC were in higher number but with a less complex morphology, suggesting an immature mitochondrial phenotype. In HD_Ne, mitochondria displayed altered movement as shown by a diminished mean speed (both retro- and anterogradly). Altogether, these data indicate that HD fibroblasts and iPSC-derived counterparts present alterations in mitochondrial function, biogenesis and dynamics, which may impact on striatal neuronal differentiation and disease progression.