The Macrophage-iNKT cells axis: macrophage survival and activation are modulated upon invariant NKT cell interaction

Abstract

As células Natural Killer T invariantes (iNKT) são linfócitos T reativos contra lípidos. Estas células expressam um recetor de células T (TCR) semi-invariante restrito à molécula CD1d, que por sua vez, é expressa por células apresentadoras de antigénios, como por exemplo, os macrófagos. Em resposta à ativação, as células iNKT desempenham importantes atividades regulatórias em várias células do sistema imunitário, como são o caso dos linfócitos B, das células dendríticas e dos macrófagos. Esta atividade regulatória é mediada por contacto direto e/ou libertação de citoquinas. Os macrófagos podem polarizar num perfil M1 (pro-inflamatório) ou M2 (anti-inflamatório) de acordo com o estímulo presente no microambiente, exercendo, assim, atividades diferentes. Além disso, foi reportado em ratinhos que as células iNKT são também capazes de polarizar os macrófagos para o fenótipo M1. Estes efeitos realçam mecanismos relevantes das células iNKT no combate à progressão tumoral.O presente trabalho tem como objetivo compreender o efeito das células iNKT na viabilidade celular e na ativação de populações distintas de macrófagos humanos. O protocolo experimental prosseguiu com macrófagos humanos em co-cultura com células iNKT sem adição de um antigénio exógeno ou com adição de diferentes concentrações de α-galactosilceramida (α-Galcer), que é o antigénio prototípico das células iNKT. Primeiramente, os monócitos foram isolados e diferenciados em macrófagos. De seguida, os macrófagos foram polarizados para os perfis M1 ou M2 através de uma estimulação com LPS e IL-10, respetivamente. Macrófagos não estimulados (M0) foram usados como controlo. Para investigar o impacto das células iNKT na viabilidade celular de macrófagos humanos, ambas as células foram colocadas em co-cultura durante 18 horas, sendo, a viabilidade celular dos macrófagos avaliada a posteriori por citometria de fluxo. Por fim, para perceber o mecanismo inerente à morte celular, foram realizadas experiências de bloqueio para as moléculas CD1d e CD40L. Os nossos resultados indicam que as células iNKT matam os macrófagos do tipo M1 em maior proporção do que os M0 e M2. As co-culturas de macrófagos M1 com células iNKT e 50 ng/mL de antigénio evidenciaram um decréscimo da viabilidade em 53% (p≤0.001). Por outro lado, as co-culturas com macrófagos M2 não apresentaram diferenças estatisticamente significativas. O mecanismo inerente à indução da morte celular sugere ser dependente da molécula CD1d. Relativamente às experiências de bloqueio para a molécula CD40L, não foi possível tirar conclusões em relação ao seu papel na indução de morte dos macrófagos. Além disso, os macrófagos viáveis de todas as subpopulações apresentavam um aumento na expressão de CD86 e CD40, o que sugere uma indução da ativação dos macrófagos por parte das células iNKT. Em simultâneo, a diminuição do recetor membranar, CD163 (marcador M2), nas populações de macrófagos M0 e M2 sugere que estas populações estão a ser polarizadas num perfil do tipo M1. Em conclusão, este trabalho mostra que as células iNKT matam preferencialmente macrófagos do tipo M1 comparativamente a M0 ou M2. Estes resultados não corroboram os observados em ratinho, que mostram que as células iNKT protegem os macrófagos com um perfil M1 e induzem uma morte seletiva dos macrófagos do tipo M2.

Invariant Natural Killer T (iNKT) cells are lipid-reactive T lymphocytes that express a semi-invariant T cell receptor (TCR) restricted to CD1d, which is expressed by antigen-presenting cells, including macrophages. In response to activation, iNKT cells play important immunoregulatory roles on several cells of the immune system, including B cells, dendritic cells and macrophages, mediated by direct contact and/ or by cytokine release. Depending on the stimuli present in the microenvironment, macrophages may polarize to M1-like (pro-inflammatory) or M2-like (anti-inflammatory), displaying distinct activities. In mice, iNKT cells play distinct roles on macrophage survival, displaying a protective activity on the M1-like phenotype and killing M2-like macrophages. Moreover, iNKT cells are capable to polarize macrophages into the M1 phenotype, in mice. Together these effects raise a relevant mechanism in tumour fighting.The present work aims to understand the effect of iNKT cells on survival and activation of distinct human macrophage subsets. The experimental protocol proceeded with human macrophage and iNKT cell co-cultures without exogenous stimuli or with different concentrations of α-galactosylceramide, the prototypic antigen of iNKT cells. First, monocytes were isolated and differentiated into macrophages. Then, macrophages were polarized into M1-like or M2-like profile through LPS or IL-10 stimulation, respectively. Unstimulated macrophages (M0) were used as controls. To investigate the effect of iNKT cells on human macrophage survival, macrophages were co-cultured with iNKT cells for 18 hours, and macrophage survival was assessed by flow cytometry. Finally, to understand the mechanisms behind cell death, blocking experiments were performed for CD1d and CD40L molecules. Our results indicate that iNKT cells kill the M1-like phenotype to a higher extent than the M0 or M2-like macrophages. Results for M1-like macrophages in co-cultures with iNKT cells and antigen (50 ng/mL) evidenced a decrease in 53% (p≤0.001) in their viability while for M2-like macrophages no statistical differences were observed. The mechanism behind cell death induction is suggested to be dependent on the CD1d molecule. Blocking experiments for CD40L were not conclusive to unveil its role on macrophage death induction. Furthermore, viable macrophages raised their CD86 and CD40 expression, suggesting an induction of macrophage activation by iNKT cells. Simultaneously, the diminishment of CD163 expression, a M2 marker, on M0 and M2-like macrophages suggested that macrophages are being polarized into the M1-like profile. In conclusion, this work shows a preferential death of M1-like macrophages induced by iNKT cells, which contrasts to results observed in mice that indicate a protection of the M1-like phenotype and a selective death induction of M2-like macrophages by iNKT cells.