Illuminating G protein-coupled receptors: a bioluminescence-based method to photoactivate receptor ligands

Abstract

Recetores acoplados à proteína G são alvos terapêuticos-chave para muitas condições patológicas. Estudos demonstraram que os recetores A2A de adenosina (A2AR) e D2 de dopamina (D2R) acoplados à proteína G formam heterómeros A2AR-D2R no estriado. A estequiometria deste heterómero encontra-se alterada na doença de Parkinson (DP) e a sinalização mediada pelos recetores A2A pode ser promovida. Deste modo, os recetores A2A são o alvo farmacológico de eleição na DP que mais tem recebido atenção nos últimos anos. No entanto, a ubiquidade deste recetor tem dificultado a seletividade no tempo e no espaço de fármacos baseados em adenosina, levando à diminuição do seu efeito terapêutico. A fotofarmacolgia tem vindo a desenvolver novos fármacos, por exemplo, compostos caged nos quais a sua atividade pode ser controlada de uma forma espácio-temporal através do uso de uma fonte de luz. MRS7145 (caged-SCH442416) foi o primeiro antagonista caged dos recetores A2A a ser sintetizado. Quando irradiado (405 nm), através de uma fonte externa de luz, este composto exibiu um perfil de antagonista relativamente aos recetores A2A em células vivas. No modelo de murganho da DP, induzido pela injeção de 6 hidroxidopamina (6-OHDA), demonstrou melhorias dos sintomas motores causados por esta doença. No entanto, a aplicação deste método envolve uma cirurgia ao cérebro complicada e requer o implante de fibras óticas, o que pode limitar a sua utilidade. O objetivo da presente tese foi avaliar se a bioluminescência gerada pela oxidação de coelenterazina 400a, através da enzima nanoluciferase (NL) acoplada ao recetor A2A (A2ARNL), seria suficiente para efetuar a libertação (uncaging) do composto MRS7145 em células vivas. Inicialmente, foi criada uma linha celular estável de células HEK-293 expressando permanentemente A2ARNL. Foram detetados baixos níveis de expressão deste recetor na membrana de células pertencentes à linha celular estável, comparativamente aos níveis detetados em células transientemente transfectadas com o mesmo vetor. Todavia, os valores acumulados de monofosfato cíclico de adenosina (cAMP) e alterações em impedância celular obtidos, após incubação com forskolina (ativador da adenilato ciclase), CGS21680 (agonista) e ZM241385 (antagonista), asseguraram a funcionalidade do recetor na linha celular criada. Além disso, 15 minutos de incubação com coelenterazina 400a, ou com o seu solvente, etanol, não provocou qualquer diminuição na viabilidade celular. No entanto, incubação com coelenterazina 400a levou à diminuição dos níveis de cAMP produzidos pela ação do agonista CGS21680, alterando as condições da ativação do recetor. Coelenterazina 400a não teve qualquer efeito na atividade do composto SCH442416 em bloquear o recetor A2A. Por fim, foi avaliado o bloqueio autónomo do recetor A2A mediado pela libertação (uncaging) do composto MRS7145 dependente da bioluminescência gerada pela enzima nanoluciferase acoplada. Quando incubado com coelenterazina 400a, o composto MRS7145 impediu a ativação do recetor de A2A mediada pelo agonista CGS21680. Resumindo, o método descrito baseado em bioluminescência, demonstrou a primeira evidência do uncaging do composto MRS7145 e subsequente libertação do composto SCH442416 em células vivas, sob um controlo espácio-temporal e independente de uma fonte externa de luz. Este método apresenta grande potencial para ser futuramente otimizado e aplicado no tratamento de distúrbios motores, incluindo a doença de Parkinson e, ainda, em terapias que visem a utilização de fármacos cuja atividade possa ser controlada por uma fonte de luz.

G protein-coupled receptors are key therapeutic targets for many pathological conditions. Studies support that the G protein-coupled adenosine A2A receptor (A2AR) and dopamine D2 receptor (D2R) form A2AR‐D2R heteromers in the striatum. The stoichiometry of this receptor heteromer is altered in Parkinson’s disease (PD) and A2AR signaling may be promoted. Hence, the A2AR represents the latest pharmacological target in PD. However, owing to the ubiquity of this receptor, it has been difficult to achieve drug selectivity in time and space for adenosine-based drugs which diminishes their therapeutic use. Photopharmacology has been developing novel drugs, e.g., caged-compounds, whose activity can be controlled in a spatiotemporal-manner with the use of a light source. MRS7145 (caged-SCH442416) was the first A2AR photo-caged antagonist to be synthesized whose external irradiation (405 nm) showed a light-dependent A2AR antagonist activity in living cells and antiparkinsonian effects in a hemiparkinsonian 6-hyroxydopamine (6-OHDA)-lesioned mouse model. However, this approach involves laborious brain surgery and optic fiber implants that may limit its utility. The aim of the present thesis was to evaluate whether the bioluminescence produced by an A2AR-coupled nanoluciferase (NL)-mediated coelenterazine 400a oxidation would be able to uncage MRS7145 in living cells. To begin with, a HEK-293 stable cell line expressing a previously engineered A2ARNL was created. Low receptor expression levels were found at the membrane of cells belonging to the stable cell line when compared to transiently transfected cells with the same construct. However, the cAMP accumulated levels and changes in cellular impedance obtained upon cell incubation with forskolin (adenylyl cyclase stimulator), CGS21680 (agonist), and ZM241385 (antagonist), ensured receptor functionality. Moreover, 15 minutes incubation with coelenterazine 400a or its solvent, ethanol, had no effect in decreasing cell viability, while incubation with coelenterazine 400a decreased CGS21680-induced cAMP accumulation altering receptor activation in the generated stable cell line. Coelenterazine 400a incubation did not affect SCH442416-induced receptor blockade. Finally, the autaptic A2AR blockade mediated by receptor’s bioluminescence-dependent uncaging of MRS7145 was evaluated. MRS7145 precluded CGS21680-induced receptor activation when incubated with coelenterazine 400a in living cells. Altogether, the described bioluminescence-based method provided the first proof of concept in uncaging MRS7145 and subsequent photorelease of SCH442416 in living cells, under a spatiotemporal control and independently of an external light source. This method demonstrates potential to be further optimized to be applied in the management of movement disorders, including Parkinson’s disease, and other prospective smart therapies which aim to utilize photocontrolled drugs.