Targeting dietary antioxidants to mitochondria to modulate redox signaling and metabolism of human fibroblasts

Abstract

Função homeostática mitocondrial e um balanço redox, são essenciais para obter vias de sobrevivência e de morte celular adequadas. Daí que a mitocôndria constitui um forte alvo para estratégias de intervenção terapêutica. Antioxidantes com base em ácidos fenólicos, abundantes na natureza, têm vindo a despertar um grande interesse devido às suas propriedades intrínsecas de regulação redox. Apesar do seu uso limitado como agentes terapêuticos devido a limitações farmacocinéticas, são moldes úteis em processos de descoberta de novos fármacos. Novos agentes mitocondriotrópicos foram desenvolvidos pelo nosso grupo – AntiOxCIN4 e AntiOxBEN2, com base em ácidos hidroxicinâmicos e hidroxibenzóicos, respetivamente, que exploram a ligação de um catião lipofílico para gerar acumulação específica na mitocôndria. Daí que, com este projeto, pretendemos não só validar o uso de novos antioxidants exogenos ligados a um catião de TPP+ como forma viável de os redirecionar à mitocôndria e com isso mitigar a frequência de eventos relacionados com o stress oxidativo, mas também revelar e compreender os potenciais efeitos que os mesmos podem ter no metabolismo celular e estado redox de fibroblastos da derme humanos normais.Aqui, estudamos a capacidade dos antioxidantes mitocôndriotrópicos de modular o metabolismo de células NHDF, a sua infuência no estado redox celular, os seus efeitos nos níveis de proteína de AMPK, as suas diferentes toxicidades dependentes da dose na massa celular, atividade metabólica e níveis de ATP, tal como potencial toxicidade mitocondrial, e finalmente a sua influência na expressão de vários transcritos mitocondriais.Demonstramos com sucesso que ambos o AntiOxCIN4 e o AntiOxBEN2 têm a capacidade de modular o metabolismo de células NHDF, uma vez que ambos aumentam a taxa glicolítica, evidenciado pelo aumento dos rácios lactato/alanina. O fluxo glicolítico de células tratadas com AntiOxBEN2 é significativamente mais alto, coerentemente acompanhado por um aumento da absorção de glucose e de produção de lactato quando comparado a células controlo não tratadas. Esta modulação metabólica não foi acompanhada por alterações na expressão de AMPK como foi hipotisado. Nenhum dos antioxidantes redirecionados à mitocôndria alterou o estado redox das células. De um modo geral, o AntOxBEN2 demonstrou uma toxicidade mais elevada, do que aquela do AntiOxCIN4, visto que células tratadas com o primeiro mostraram maiores diminuições da massa celular, atividade metabólica e níveis de ATP.Privação celular de glucose na presença de glutamina e piruvato provou ser um excelente indicador da toxicidade de um composto sobre a mitocôndria quando acompanhado da medição dos níveis celulares de ATP e de ensaios de citotoxicidade. Mostramos que a presença de AMPK é essencial para despertar uma adaptação celular quando os antioxidantes mitocondriotrópicos são adicionados a células. Adicionalmente, provamos que a presença de AntiOxCIN4 não afeta negativamente a respiração mitocondrial, ao contrário de células tratadas com AntiOxBEN2 que mostram uma capacidade respiratória deficiente juntamente com uma menor capacidade de produção de ATP.Os níveis de expressão genética de Glut-1 e Hif-1α estavam aumentados (em 75.27% e 34.82%, respetivamente) em células tratadas com AntiOxBEN2 quando comparado a células controlo, possivelmente ajudando à compreensão da maior incorporação de glucose e do comportamento glicolítico hiperativo observado durante todo o projeto. Células tratadas com AntiOxBEN2 também mostraram níveis mais baixos de LC3 e de PINK, ambos os quais são marcadores de autofagia, sugerindo que o tratamento com AntiOxBEN2 pode diminuir a capacidade autofágica de células NHDF. Por outro lado, AntiOxCIN4, praticamente não mostra efeitos negativos em células tratadas, mantendo porém todos os benefícios antioxidantes.

Homeostatic mitochondrial function and redox balance is essential for proper cellular survival and death signaling. Thus, mitochondria pose as strong targets for therapeutic intervention strategies. Antioxidants based on naturally-occurring phenolic acids have shown great pharmacological interest due to their intrinsic redox regulating properties. Despite their limited use as therapeutic agents due to pharmacokinetic drawbacks, they are useful scaffolds in drug discovery processes. Novel mitochondriotropic agents developed by our research group AntiOxCIN4 and AntiOxBEN2, based on hydroxycinnamic and hydroxybenzoic acids, respectively, exploit the covalent binding of a lipophilic cation to drive specific accumulation in mitochondria. Thus, with this global project we intend to not only validate the use of novel exogenous antioxidants coupled to a TPP+ cation as a viable way of targeting mitochondria and mitigating oxidative stress related events, but also to reveal and understand the broad spectrum of potential cellular effects that they might have on the cellular metabolism and redox state of normal human dermal fibroblasts.Herein, we studied the mitochondriotropic antioxidants’ ability to modulate NHDF cell metabolism, their influence on cellular redox state, their effects on AMPK protein levels, their different dose-dependent toxicologic patterns on cell mass, metabolic viability and ATP levels, as well as potential mitochondrial toxicity, and finally their influence on the expression of several mitochondrial transcripts.We successfully demonstrate that both AntiOxCIN4 and AntiOxBEN2 have the ability to modulate the cellular metabolism of NHDF cells, as both compounds increase the cells’ glycolytic rate, as observed by increased lactate/alanine ratios. The glycolytic flux of cells treated with AntiOxBEN2 is significantly higher, coherently, paired with a higher uptake of glucose and lactate production when compared to that of control untreated cells. This metabolism modulation was not accompanied by changes in AMPK expression as was hypothesized. None of the mitochondria-targeted antioxidants altered the cellular redox state. Overall, AntiOxBEN2 demonstrated higher toxicity than AntiOxCIN4 as a larger decrease of cell mass, metabolic viability and ATP occurred when cells were treated with the former.Cellular glucose deprivation in the presence of glutamine and pyruvate proved to be an excellent indicator of a compound’s toxicity on mitochondria when coupled with the measurement of ATP levels and cytotoxicity assays. We show that the presence of AMPK is essential for the metabolic adaptation observed when the mitochondriotropic antioxidants were added to cells. Additionally, we proved that the presence of AntiOxCIN4 does not negatively affect mitochondrial respiration, unlike AntiOxBEN2-treated cells which show deficient respiratory and ATP producing capabilities.Glut-1 and Hif-1α gene expression levels were increased (by 75.27% and 34.82%, respectively) in AntiOxBEN2-treated cells when compared to control cells, possibly helping to explain the higher glucose uptake and glycolytic behavior seen throughout this work. AntiOxBEN2-treated cells also presented lower LC3 and PINK levels, both of which are autophagy markers, implying that AntiOxBEN2 may diminish the autophagic capability of NHDF cells. AntiOxCIN4, on the other hand, shows little to no negative effects on treated cells, whilst maintaining all of the antioxidant benefits.