CRISPR-Cas9 as a tool for gene therapy in Machado-Joseph disease: silencing ATXN3 and CAG expansion correction

Abstract

Machado-Joseph disease (MJD), also known as spinocerebellar ataxia type 3, is a neurodegenerative disorder considered to be the most common form of autosomal dominantly-inherited ataxia in the world. It is a rare disorder, although it has a significative prevalence in some regions of Portugal, especially in the archipelago of Azores. MJD symptoms include a loss of motor coordination and other neurological signs, with the cerebellum being the most affected brain region. MJD arises from an abnormal CAG trinucleotide expansion within the exon 10 of the human ATXN3 gene, which encodes for a protein named ataxin-3 (atxn-3), that bears an aberrant polyglutamine (polyQ) tract in the disease context. The exact biological function of atxn-3 is not fully understood, but it has been described that, when expanded atxn-3 undergoes a toxic gain-of-function that deregulates normal cellular pathways leading to neuronal loss. Recently, it has been suggested that abnormal CAG tracts in mRNA transcripts might also be toxic. As with other polyglutamine diseases, greater numbers of CAG repeats are associated with earlier ages of onset and more severe symptoms.Currently, no therapies capable of delaying or treating the disease are available, and MJD remains a fatal disorder. Many of the therapeutic strategies that have been tested act at a post-transcriptional level, being unable to prevent the putative toxicity of CAG expanded mRNA transcripts. Therefore, new strategies that act at a pre-transcriptional level may be advantageous.However, disease studies can only be robust and feasible when the adequate disease model is used. Yet, the available mouse models used to study MJD either fail to properly mimic the actual genetic context of the disease or are of limited use due to slow and mild symptom progression.In the last decade, the field of gene editing has been thriving. The use of the CRISPR/Cas9 system as a tool for gene editing brought the possibility of performing low-cost, flexible and easy genomic manipulation virtually at any loci. Moreover, CRISPR/Cas9 variants, such as the catalytic inactivated Cas9 (dCas9) have shown promising results regarding gene transcription regulation. In the first part of this work, we planned to establish an in vitro strategy to refine the yeast artificial chromosome (YAC) MJD-Q84.2 mouse, which is the MJD model that best recapitulates the symptoms and the genetic context of the human condition. In this work we proposed to use gene editing tools to overexpand the ATXN3 CAG tract in the exon 10, from 84 to 141 CAG; applying this strategy to the model would be expected to generate a robust mouse model that displayed a more severe phenotype and an earlier disease onset, comparing to the YAC MJD-Q84.2 model. However, the in vitro results here presented, using HEK 293T cells, showed that the strategy used was inefficient at overexpanding the CAG repeats.At the same time, a CRISPR/Cas9-based strategy for correcting the pathogenic ATXN3 gene that could be used to generate isogenic MJD patient-derived cell lines was also tested. The study here presented, using HEK 293T cells, showed that it is possible to integrate a DNA fragment containing 14 CAG repeats plus a selection cassette in the exon 10 of the ATXN3 gene. However, this strategy was not completely infallible, and integration seemed to be independent from Cas9 activity. In the second part of this work, we assessed the effects of dCas9-KRAB as a strategy to pre-transcriptionally silence mutant ATXN3 in a MJD mouse model. In vivo results showed that this approach has a therapeutic potential to improve motor performance in a severely-impaired transgenic mouse model of MJD.

A doença de Machado-Joseph (DMJ), também conhecida por ataxia espinocerebelosa tipo 3, é uma doença neurodegenerativa e a forma mais comum de ataxia hereditária dominante no mundo. É uma doença rara, porém tem uma prevalência significativa em algumas regiões de Portugal, nomeadamente no arquipélago dos Açores. Os sintomas de DMJ incluem perda de coordenação motora bem como outros sinais neurológicos, sendo o cerebelo a região do cérebro mais afetada. A DMJ surge de uma expansão anormal de trinucleótidos CAG no exão 10 do gene ATXN3, que codifica para a proteína ataxina-3 (atxn-3). No contexto da doença, a atxn-3 contém uma sequência de glutaminas (poliQ) anormalmente longa. As funções biológicas da proteína atxn-3 não são totalmente conhecidas, contudo tem sido descrito que a atxn-3 expandida adquire uma função tóxica que desregula o normal funcionamento de diversos sistemas celulares, levando à morte neuronal. Recentemente, tem sido sugerido que tratos CAG anormais presentes em transcritos de mRNA podem também ser tóxicos. Tal como em outras doenças de poliglutaminas, um maior número repetições CAG tem sido associado a sintomas mais severos, com um aparecimento mais precoce.Atualmente, não há terapias capazes de tratar ou atrasar o curso da doença, e, portanto, a DMJ continua a ser fatal. Algumas estratégias terapêuticas que têm sido testadas atuam ao nível pós-transcricional e são por isso incapazes de prevenir os putativos efeitos tóxicos dos transcritos de mRNA que contêm uma cadeia de CAGs expandida. Assim sendo, novas estratégias que atuem a um nível pré-transcricional podem vir a ser vantajosas.O estudo de doenças humanas apenas consegue ser robusto quando é usado um modelo de doença adequado. Porém, os modelos de murganho presentemente usados para estudar a DMJ ou não reproduzem de forma fiel o contexto genético da doença ou apresentam sintomas pouco acentuados e uma progressão lenta que limitam a sua utilização.Na última década, a área da edição genética tem tido desenvolvimentos extraordinários. O uso da CRISPR/Cas9 como uma ferramenta para edição genética trouxe a possibilidade de manipular o genoma virtualmente em qualquer locus, de uma forma barata, fácil e flexível. Além do mais, variantes da CRISPR/Cas9, como é o caso da Cas9 cataliticamente inativa (dCas9), têm mostrado resultados promissores no que diz respeito à regulação da transcrição genética.Na primeira parte deste trabalho pretendemos estabelecer uma estratégia in vitro para aperfeiçoar um modelo de DMJ em murganho designado por yeast artificial chromosome (YAC) MJD-Q84.2, que é considerado como o modelo que melhor recapitula os sintomas e o contexto genético humano em condições de doença. Neste trabalho, utilizámos ferramentas de edição genética para sobreexpandir o trato CAG do exão 10 do gene ATXN3, de 84 para 141 CAGs; ao aplicar esta estratégia ao modelo de murganho seria expectável que se criasse um modelo robusto, com um fenótipo mais severo e em que os sintomas se manifestassem mais cedo em comparação com o já existente modelo YAC MJD-Q84.2. Contudo, os resultados in vitro descritos neste trabalho mostraram que a estratégia usada parece ser ineficiente na sobreexpansão das repetições CAG em células HEK 293T.Paralelamente, usando também a CRISPR/Cas9, foi testada uma estratégia para corrigir o gene ATXN3 mutante, que pudesse ser usada para criar linhas celulares isogénicas derivadas de pacientes de DMJ. O estudo aqui apresentado, usando células HEK 293T, mostrou ser possível integrar um fragmento de DNA contendo 14 repetições do trinucleótido CAG e uma cassete de seleção no exão 10 do gene ATXN3. Contudo, esta abordagem não se mostrou totalmente fiável e que foi detetada integração independente da atividade da Cas9.Na segunda parte deste trabalho foram avaliados os efeitos da dCas9-KRAB como estratégia de silenciamento a nível pré-transcricional do gene humano da ATXN3 num modelo animal de DMJ. Os resultados in vivos mostraram que esta abordagem tem potencial terapêutico, melhorando a performance motora num modelo DJM transgénico severamente afetado.