Analysis of the Efficacy and Safety of Spermicides with Benzalkonium Cholride and Myristalkonium Chloride as Active Principles

Abstract

Nos países em desenvolvimento, nomeadamente na África Subsariana, América Latina e Sudoeste Asiático a maioria das mulheres tem pouco ou nenhum poder político e social, acompanhado de um acesso limitado a serviços de saúde e métodos contracetivos. Estes fatores criam condições desfavoráveis à vida sexual e materna destas mulheres, culminando em elevadas taxas de gravidez não desejada e aborto. Existe, por isso, a necessidade urgente de desenvolver métodos contracetivos que sejam de controlo feminino e capazes de responder às necessidades pessoais e culturais das mulheres destes países.Os surfatantes são compostos com efeito disruptivo e elevado potencial espermicida, capazes de promover a perda da integridade lipídica da membrana e lise celular. No entanto estes compostos podem eventualmente modular vias celulares específicas dos espermatozoides, incapacitando-os de fertilizar. A história dos espermicidas surfactantes encontra-se estreitamente relacionada com a história do nonoxynol-9 (N9), um detergente não iónico extremamente tóxico e gerador de grandes efeitos secundários, nomeadamente ao nível do epitélio vaginal. No entanto, os surfatantes catiónicos foram apontados como fortes candidatos no desenvolvimento de espermicidas seguros. No presente estudo, diferentes concentrações de cloreto de benzalcónio (BKC) e cloreto de miristalcónio (MKC) foram testadas relativamente à sua eficácia e segurança in vitro, e os seus efeitos foram comparados com o controlo negativo (sem tratamento) e positivo (N9), de forma a avaliar se seria possível a identificação de um intervalo de concentrações em que os compostos apresentassem simultaneamente uma potente capacidade espermicida e boa tolerância para o epitélio cervical/vaginal.Em primeiro lugar a atividade espermicida dos compostos foi avaliada tendo em atenção os efeitos dos mesmo sobre a mobilidade, viabilidade e estado do acrossoma dos espermatozoides, após incubações de 0 e 10 minutos. Seguidamente, o seu efeito sobre a capacidade de penetração dos gâmetas masculinos numa matriz de metilcelulose, usada para mimetizar muco cervical, foi avaliada usando as mesma concentrações e tempos de incubação. Por fim, uma avaliação in vitro da segurança do BKC e do MKC foi realizada tendo por base a análise da viabilidade e estado metabólico das células HeLa, usadas aqui como modelo do epitélio cervical, após 0 e 1 hora de incubação.A elevadas concentrações (iguais ou superiores a 6,8x10-1 mM) ambos os compostos causaram uma perda total de viabilidade e mobilidade espermática, e declínio acentuado da integridade dos acrossomas, acompanhado por uma redução da capacidade de penetração na matriz de metilcelulose contendo BKC e MKC. A estas concentrações, a toxicidade promovida pelos compostos nas células HeLa é extremamente elevada, levando à perda de viabilidade e atividade metabólica. Estes tratamentos causaram efeitos semelhantes aos do N9, atuando como detergentes clássicos, com elevada capacidade espermicida e extrema toxicidade.xiiPor outro lado, entre 6,8x10-4 e 6,8x10-3 mM, o BKC e o MKC apresentaram um efeito ligeiro ou nulo sobre a viabilidade e metabolismo das células HeLa e sobre a mobilidade e viabilidade dos espermatozoides. Também não houve alteração da classificação e capacidade de penetração relativamente ao controlo negativo. Porém, continuaram a promover um decréscimo significante na percentagem de espermatozoides com acrossoma intactos, indicando que estes surfatantes estão a atuar de forma mais subtil, afetando vias celulares específicas que podem incapacitar o espermatozoide de fertilizar. Assim sendo, nestas concentrações os compostos apresentam o potencial de reduzir a capacidade de fertilização dos gametas masculinos sem causar efeitos adversos para as células HeLa in vitro, o que representa um bom ponto de partida para outros estudos pré-clínicos.Apesar deste estudo não ter permitido a identificação de concentrações em que o BKC e/ou o MKC sejam eficazes e seguros ao mesmo tempo, possibilitou a análise dos seus efeitos. Em trabalhos futuros, será importante entender que outras vias celulares poderão estar a ser modeladas pelo BKC e o MKC, de modo a ter uma visão aprofundada do potencial total dos compostos enquanto espermicidas. Adicionalmente, mais testes serão necessários para entender como poderão estes compostos afetar o epitélio vaginal a longo prazo, se os efeitos são reversíveis, e quantas aplicações destes compostos poderão ser realizadas, descobrindo assim informação relevante quanto a intervalos entre aplicações e frequência das mesmas que deverão posteriormente ser testados in vivo.

Most women in Sub-Saharan Africa, Latin America and Southwestern Asia have poor or no political and social power, accompanied by limited access to health services and contraceptive methods. These factors create unfavorable conditions for the sexual and maternal life of these women, culminating in high rates of unwanted pregnancy and abortion. Therefore, there is an urgent need to develop contraceptive methods that are female-controlled and capable to respond to the personal and cultural needs of these women.Surfactants are compounds with disruptive effects and high spermicidal potential that cause loss of lipid membrane integrity and cell lysis. But their effects may also modulate sperm-specific cellular pathways, turning them incompetent to fertilize. The history of surfactant spermicides is closely related with the history of nonoxynol-9 (N9), an extremely toxic nonionic detergent with serious side effects, notably in terms of the cervical/vaginal epithelium. However, cationic surfactants have been identified as strong candidates in the development of new safe spermicides. In the present study, different concentrations of the cationic surfactants benzalkonium chloride (BKC) and myristalkonium chloride (MKC) were tested for their in vitro efficacy and safety, and their effects were compared with the negative (untreated) and positive (N9) controls to assess whether it will be possible to identify a concentration range where the compounds have potent spermicidal capacity while presenting good tolerance to the cervical/vaginal epithelium.Initially, the spermicidal activity of the compounds as evaluated taking into account their effect on sperm motility, viability and acrosome status after 0 and 10 minutes of incubation. Thereafter, their effect on sperm penetration capacity in a methylcellulose matrix, used to mimic the cervical mucus, was evaluated using the same concentrations and times of exposure. Finally, an in vitro safety assessment was performed by analyzing the impact of BKC and MKC on the viability and metabolic status of HeLa cells, used as model for cervical epithelium, after 0 and 1 hour of incubation.At high concentrations (equal or above 6.8x10-1 mM) the compounds were able to promote total loss of viability and motility and an extreme decline in acrosome integrity, accompanied by reduced penetration capacity in the methylcellulose matrix impregnated with the compounds. At these concentrations, the toxicity of the compounds on HeLa cells was extremely high, leading to the loss of viability and metabolic activity. These treatments caused similar effects to those of N9, acting as classic detergents, with high spermicidal capacity and toxicity.On the other hand, between 6.8x10-4 and 6.8x10-3 mM, BKC and MKC had low or no effect on HeLa cell viability and metabolism and on sperm motility and viability. There was also no decrease in the classification of penetration capacity. However, they continued to exert a significant decrease in the percentage of intact acrosomes, which may indicate that these surfactants are acting more subtly, affecting specific cell pathways that may disable sperm from fertilizing. Thus, at these concentrationsixthe compounds have the potential to reduce the fertilization capacity of male gametes without causing adverse effects to HeLa cells in vitro, which may represent a good start for other pre-clinical studies.Although this study did not allow the identification of concentrations in which BKC and/or MKC are effective and safe at the same time, it permitted an analysis of their effects. In future work it will be important to understand which cellular pathways are being modulated by BKC and MKC in order to gain a stronger insight of the full potential of these compounds as spermicides. In addition, further testing is needed to understand how the compounds may be compromising the epithelium on the long-run, if the effect are reversible, and how repeated applications of these compounds may influence cells, providing clues for safe application intervals and frequencies for users that will have to be tested in vivo.