Development of methodologies for permeability and vesicle fusion evaluation

Abstract

A membrana biológica é uma estrutura complexa através da qual alguns fenómenos importantes acontecem e, por isso, as suas propriedades têm sido alvo de estudo ao longo dos anos. O objetivo do presente trabalho é avaliar a permeabilidade e fusão de vesículas através de várias metodologias.Na literatura é reportado que as ondas fotoacústicas (PA) aumentam a eficiência de absorção de fármacos por aplicação transdérmica. Nesta dissertação tentou-se avaliar qual o mecanismo responsável e se envolve a perturbação da bicamada lipídica.Para isso, estudo de permeabilidade foram feitos através da cinética de libertação de uma molécula fluorescente (fluoresceína). Tentou-se sintetizar um derivado de maior peso molecular, obtendo produtos que requerem ainda passos de purificação. De forma a continuar o trabalho, escolheu-se utilizar a FITC-dextran (fluoresceína isotiocianato-dextran) pelo seu elevado peso molecular e foi encapsulada em vesículas unilamelares gigantes (GUVs) para realizar estudos preliminares de permeabilidade.O protocolo de produção de GUVs assistido por polyvinil álcool (PVA) foi adaptado da literatura. Amostras de GUVs foram submetidas a diferentes testes de estabilidade de forma a otimizar condições para a aplicação de ondas fotoacústicas.O efeito das ondas PA na fusão entre vesículas também foi averiguado, pois a entrega de fármacos via fusão de uma vesícula portadora com uma célula é muito versátil e permite a entrega de fármacos tanto polares como apolares.Foram produzidas vesículas unilamelares grandes (LUVs) para avaliar a fusão entre vesículas, que foi feito calculando a eficiência de transferência de energia (EET) através da transferência de energia por ressonância de Förster (FRET). A EET foi obtida por medições de fluorescência em estado estacionário e resolvida por tempo. Para promover a fusão entre as vesículas, a composição lipídica foi diversificada e duas metodologias para a obtenção da EET foram adotadas: mistura de LUVs com diferentes sondas e aplicação de ciclos de Freeze and Thaw; e utilizando diferentes percentagens de LUVs formados com as duas sondas. Neste estudo o par de sondas fluorescentes escolhido foi 7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl (NBD) e lissamina-rhodamina B sulfonil. Os LUVs foram também caracterizados por dispersão dinâmica de luz (DLS) e pelo seu potencial zeta.

The biological membrane is a complex structure through which important phenomena take part and its properties have been studied over the years. The aim of the present study is to evaluate the permeability and vesicle fusion by several methodologies. It has previously been reported that photoacoustic (PA) waves increase the absorption efficiency of drugs through transdermal application. With this thesis it was intended to evaluate what is the mechanism responsible and if it involves perturbation of the lipid bilayer. For that, permeability studies were done by assessing the kinetics of release of a fluorescent probe (fluorescein). The synthesis of a derivative with higher molecular weight was attempted, resulting in products that needed further purification. So, in order to pursue the work, FITC-dextran (fluorescein isothiocyanate-dextran) was chosen for its high molecular weight and preliminary permeability studies were done by encapsulation in Giants Unilamellar Vesicles (GUVs). The protocol of GUV formation was adapted from literature using polyvinyl alcohol (PVA) assisted method. GUVs samples were subjected to different stability tests to optimize conditions for the application of PA waves. The effect of PA waves in fusion between vesicles was also evaluated because the delivery of drugs via fusion of a drug carrier vesicle with a receiving vesicle is very versatile and allows both polar and apolar drugs to be delivered. LUVs were produced to assess fusion between vesicles, which was done by calculating the Efficiency of Energy Transfer (EET) from Förster Resonance Energy Transfer (FRET). EET was evaluated from steady-state and time-resolved fluorescence measurements. To promote fusion between vesicles the lipid composition was modified and two methodologies for obtaining the EET values were adopted: mixing LUVs with different probes and applying Freeze and Thaw cycles; and using different percentages of LUVs with both probes. In this work, the donor-acceptor pair chosen was NBD and Lissamine Rhodamine B sulfonyl. The LUVs were also characterized by Dynamic Light Scattering (DLS) and zeta potential.