Pesquisa dos protozoários Giardia e Cryptosporidium em moluscos bivalves através de técnicas moleculares

Abstract

Giardia e Cryptosporidium são dois protozoários que infetam o homem e animais, tendo sido detetados com alguma frequência em moluscos bivalves. Ambos parasitas têm ciclos de vida adequados para que haja infeção e transmissão por via hídrica e pelos alimentos. Os quistos de Giardia e os ooquistos de Cryptosporidium são as formas infetantes e são muito resistentes às condições ambientais e aos tratamentos químicos efetuados à água para consumo humano. Estas estruturas de resistência permanecem viáveis na água durante meses podendo contaminar o homem e animais bem como a fauna aquática nomeadamente moluscos bivalves.Em Portugal é escassa a pesquisa destes protozoários em alimentos. Assim, o presente trabalho teve como objetivo pesquisar Giardia e Cryptosporidium em moluscos bivalves através de técnicas moleculares e fazer uma análise do risco alimentar para a saúde pública associado ao consumo destes moluscos. Ostras de três espécies, Ostrea edulis, Crassostrea gigas e Crassostrea angulata, foram recolhidas em diferentes zonas de Portugal pelo Instituto Português do Mar e da Atmosfera (IPMA) no período de 2011 a 2017. O ADN das ostras (n=190) foi extraído utilizando-se o kit DNeasy Blood & Tissue (Qiagen) e a deteção de Giardia e Cryptosporidium foi realizada por técnicas de PCR (nested-PCR e qPCR). A identificação das espécies e genótipos foi realizada por sequenciação.O locus do gene ssu rRNA de Giardia foi amplificado por nested-PCR em 29 amostras de ostras (15,3%). Destas 29 amostras positivas, só 12 amostras foram sequenciadas com sucesso. O alinhamento das sequências identificou a espécie Giardia lamblia em todas as amostras com 99-100% de homologia com sequências de referência. Através do estudo das posições nucleotídicas foram caracterizadas 10 amostras no genótipo A. Recorrendo ao qPCR específico dos genótipos A e B, genótipos responsáveis pela doença no homem, foi possível identificar o genótipo A de Giardia lamblia em 28 amostras.Relativamente à deteção do protozoário Cryptosporidium, 17 amostras apresentaram fraca amplificação no nested-PCR e como não ocorreu amplificação no qPCR foram consideradas negativas. Em conclusão, as técnicas de biologia molecular foram aplicadas com sucesso, detetou-se o genótipo A de G. lamblia em ostras, podendo o seu consumo representar um risco para a saúde pública.

Giardia and Cryptosporidium are two protozoan that infect man and animals and have been detected with some frequency in bivalve molluscs. Both parasites have adequate life cycles for infection and transmission by water and food. Giardia cysts and Cryptosporidium oocysts are the infective forms and are very resistant to environmental factors as well as to chemical treatments applied to water for human consumption. These resistance structures remain viable in the water for months and may contaminate man and animals as well as aquatic fauna including bivalve molluscs. In Portugal the research of these protozoans in food is scarce. Thus, the present work aimed to investigate the presence of Giardia spp. and Cryptosporidium spp. in bivalve molluscs applying molecular techniques and to make an analysis of the food risk to public health associated to their consumption. Oysters of three species, Ostrea edulis, Crassostrea gigas and Crassostrea angulate, were collected in different areas of Portugal by the Portuguese Institute of the Sea and Atmosphere (IPMA) between 2011and 2017. Oyster DNA (n=190) was extracted using the kit Tissue DNA Extration (Qiagen) and the detection of Giardia and Cryptosporidium was performed by PCR techniques (nested-PCR and qPCR). The identification of the species and genotypes was performed by sequencing.The locus gene ssu rRNA of Giardia was amplified by nested-PCR in 29 oyster samples (15.3%). However, it was only possible to sequence 12 samples. Sequence alignment identified the Giardia lamblia in all samples, with 99-100% homology with reference sequences, and allowed to identify genotype A in 10 samples. Using specific-qPCR of genotype A and B, genotypes responsible for the disease in humans, allow the identification of G. lamblia genotype A in 28 samples.Regarding the detection of Cryptosporidium, 17 samples showed weak amplification in the nested-PCR and no amplification in the qPCR, and so were considered negative. In conclusion, the molecular biology techniques were successfully applied, detecting genotype A of G. lamblia in oysters. The consumption of this shellfish food could pose a risk to public health.