Regulation of NMDA receptor dynamics by BDNF in cultured neurons

Abstract

As sinapses glutamatérgicas localizam-se em pequenas protrusões dendríticas denominadas espículas dendríticas. Estas estruturas responsáveis por uma grande parte da neurotransmissão excitatória no sistema nervoso central (SNC), são entidades altamente especializadas e dinâmicas. Os terminais nervosos que contactam com as espículas dendríticas contêm a maquinaria necessária para a síntese e libertação local de glutamato, o principal aminoácido excitatório do SNC. A sinalização por glutamato é mediada por uma família de recetores transmembranares que são classificados em recetores metabotrópicos (mGluR) e recetores ionotrópicos (iGluR). Os recetores N-metil-D-aspartato (NMDA) pertencem à segunda categoria, sendo formados pela oligomerização de subunidades do tipo GluN1, GluN2 e GluN3, que formam um canal iónico heteromérico. A ativação de recetores NMDA é caracterizada por uma abertura lenta do canal, resultando no influxo de catiões, que por sua vez induzem a ativação de diversas cascatas de sinalização e propagação do sinal nervoso. Os recetores NMDA possuem um carácter dinâmico, encontrando-se em constante movimentação, caracterizada por uma rápida inserção e remoção da membrana plasmática neuronal; apresentam também movimentos de difusão membranar, para o interior e exterior da área sináptica. Esta dinâmica é estritamente regulada através de modificação pós-traducionais, principalmente nas subunidades GluN2. Estas alterações estão envolvidas em processos de plasticidade sináptica, um mecanismo celular associado à aprendizagem e formação de memória. Anomalias na função dos recetores NMDA têm sido relacionadas com doenças neurológicas, tais como epilepsia, depressão, Alzheimer, doença de Huntington e esquizofrenia.Resultados do nosso laboratório mostraram que o BDNF aumenta a expressão de recetores NMDA contendo subunidades GluN2B ao nível da membrana plasmática e na sinapse em neurónios do hipocampo em cultura. Verificou-se ainda que este efeito era dependente da síntese proteica, e mediado pela ativação da cinase Pyk2 no compartimento sináptico. O BDNF é uma neurotrofina que desempenha um papel fundamental no desenvolvimento, na fisiologia e em processos patológicos do SNC. No entanto, os mecanismos pelos quais o BDNF regula a dinâmica dos recetores NMDA ao nível da membrana plasmática ainda não são conhecidos. Para investigar os mecanismos sinápticos responsáveis pelos efeitos do BDNF na distribuição dos recetores NMDA contendo subunidades GluN2B, neste trabalho investigámos o efeito desta neurotrofina na difusão dos recetores ao nível da membrana em neurónios do hipocampo em cultura. Além disso, caracterizámos a modulação da dinâmica das subunidades GluN2B associadas à membrana plasmática pela Pyk2, uma cinase de resíduos de tirosina que é ativada na sequência da estimulação dos recetores TrkB. Os resultados obtidos usando imagiologia in vivo de partícula única mostraram que o BDNF aumenta o confinamento sináptico de recetores NMDA contendo subunidades GluN2B, diminuindo a sua mobilidade superficial, e sugerem que este efeito pode ser mediado pela Pyk2.Considerando os efeitos distintos que foram descritos para o BDNF em diferentes tipos de neurónios, investigámos em seguida se esta neurotrofina também regula a expressão sináptica de recetores NMDA contendo subunidades GluN2B em neurónios do córtex cerebral, à semelhança do que foi anteriormente observado em neurónios do hipocampo em cultura. Além disso, avaliámos a expressão sináptica de recetores NMDA contendo subunidades GluN2A em neurónios do córtex cerebral em cultura incubados com BDNF. Experiências de imunocitoquímica mostraram que a sinalização pelo BDNF tem um efeito distinto nos neurónios do córtex cerebral quando comparados com os neurónios do hipocampo em cultura. De facto, a estimulação dos neurónios do córtex cerebral com BDNF não alterou a expressão sináptica dos recetores GluN2B-NMDA, mas observou-se um aumento dos níveis da subunidade GluN2A ao nível da sinapse nas mesmas condições. Por fim, investigámos o efeito de uma forma mutante de stargazin, associada à esquizofrenia, na expressão à superfície dos recetores NMDA contendo subunidades GluN2A. Não foram encontradas alterações na expressão à superfície dos recetores GluN2A-NMDA nos neurónios do córtex cerebral em que se expressou a forma mutante a stargazin, mas a redução dos níveis da proteína endógena diminuiu a expressão sináptica dos recetores. Pelo contrário não foram observadas alterações na expressão de recetores GluN2B-NMDA com a redução dos níveis endógenos da proteína stargazin.Em conclusão, este trabalho contribui para uma melhor compreensão dos mecanismos responsáveis pela modulação das sinapses glutamatérgicas pelo BDNF. Os resultados obtidos são relevantes para compreender processos fisiológicos como aprendizagem e memória, assim como para o estudo das alterações na neurotransmissão glutamatérgica que ocorrem diversas patologias do SNC.

Glutamatergic synapses, located in small dendritic protrusions called dendritic spines, are highly specialized and dynamic entities responsible for excitatory neurotransmission. These synapses are characterized by the local synthesis and release of glutamate, the major excitatory amino acid of the Central Nervous System (CNS). Glutamate signaling is mediated by activation of a family of transmembrane receptors classified into two categories, metabotropic glutamate receptors (mGluRs) and ionotropic glutamate receptors (iGluRs). N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors belong to the iGluRs family, and their regulation is important in the formation, maturation and maintenance of functional synapses. These receptors are constituted by oligomerization of GluN1, GluN2 and GluN3 subunits, which form heteromeric ion channels. The activation of NMDA receptors is characterized by a slow channel opening resulting in the influx of cations, which in turn induces the activation of several signaling cascades and neurotransmission propagation. NMDA receptors are dynamic entities, showing a rapid insertion and removal from the neuronal plasma membrane, as well as membrane diffusion movements to and out of the synapse area. The dynamic nature of NMDAR receptors is determined and modulated through different post-translational modification processes, mainly at the GluN2 subunits, which partly account for synaptic plasticity, a cellular mechanism that is associated with learning and memory formation. Abnormalities in NMDA receptor function have been associated with neurologic disorders, namely epilepsy, depression, Alzheimer’s disease, Huntington’s disease and schizophrenia. Previous observations from our laboratory indicate that BDNF increases the plasma membrane and synaptic expression of GluN2B-containing NMDA receptors in cultured hippocampal neurons, in a protein synthesis-dependent manner, by a mechanism requiring the activation of the Pyk2 kinase at the synaptic compartment. BDNF is a neurotrophin which also plays a key role in the development, physiology and pathologic processes in the CNS. However, the mechanisms whereby BDNF regulates the surface dynamics of NMDA receptors is not yet known. To characterize the mechanisms underlying the modulation of GluN2B-containing NMDA receptors by BDNF at the synapse, in this work we investigated the effect of this neurotrophin on the membrane diffusion of the receptors in cultured hippocampal neurons. Furthermore, we analyzed the modulation of GluN2B surface dynamics by Pyk2, a tyrosine kinase that is activated downstream of TrkB receptors. The results obtained using single particle live imaging show that BDNF increases the synaptic confinement of GluN2B-containing NMDA receptors, decreasing their surface mobility, and suggest that this effect may be mediated Pyk2.Considering the distinct effects that have been reported for BDNF in different types of neurons, we investigated whether the neurotrophin also upregulates the synaptic expression of GluN2B-containing NMDA receptors in cerebral cortical neurons, as previously reported in hippocampal neurons. Moreover, we evaluated the synaptic expression of GluN2A-containing NMDA receptors in cortical neurons incubated with BDNF. Immunocytochemistry experiments showed that BDNF signaling has a distinct effect in cerebral cortical neurons when compared with hippocampal neurons. In fact, stimulation of the former preparation with BDNF did not change the synaptic expression of GluN2B-NMDA receptors, but an increase in synaptic GluN2A was observed under the same conditions.At last, we investigated the effect of a mutated form of stargazin, associated to schizophrenia, in the surface expression of GluN2A-containing NMDA receptors. No alterations were found in the surface expression of GluN2A-NMDA receptors in cerebral cortical neurons expressing the mutant form of stargazing, but knock-down of this protein decreased the synaptic expression of the receptors. In contrast, no alterations were observed in the expression of GluN2B-containing NMDARs with a knocking-down of stargazin.In conclusion, this work contributes to a better understanding of the mechanism underlying the modulation of glutamatergic synapses by BDNF. This is relevant to understand physiological process such as learning and memory, as well as for the study of the alterations in glutamatergic neurotransmission occurring in pathologic conditions.