Estimulação angiogénica de tecido ovárico criopreservado

Abstract

A criopreservação do tecido cortical ovárico é uma forma de preservar a fertilidade de jovens mulheres em idade reprodutiva e de crianças pré-púberes. Apesar de começar a ser aceite como técnica rotineira, um dos aspetos que limita o sucesso na sua utilização é a sobrevivência e o tempo de vida do enxerto, provavelmente devido à isquemia inicialmente induzida. O presente trabalho procurou avaliar o efeito de um pré-tratamento in vitro de tecido ovárico de rato criopreservado com os fatores pró-angiogénicos, VEGF (fator de crescimento vascular endotelial) e bFGF (fator de crescimento fibroblástico básico), juntamente com a gonadotropina menopáusica humana (hMG), para avaliar o potencial efeito na estimulação de passos iniciais da angiogénese. Para isso, foram estudados tecidos imediatamente após ovariectomia (TOF 0h), tecidos após a criopreservação lenta e descongelação (TOPC 0h), após as 4h de cultura sem nenhum tratamento (TOPC 4h), tecidos cultivados apenas com os fatores de crescimento (TOPC 4h+VEGF+bFGF), ou com apenas a hMG (TOPC 4h+hMG), e finalmente com os três fatores (TOPC 4h+VEGF+bFGF+hMG). Avaliou-se a densidade folicular e proporção de diferentes tipos de folículos, a proliferação do tecido através da marcação imunohistoquímica com Ki-67, a apoptose através da caspase activa-3 (AC-3) e a expressão do marcador vascular, fator VIII. Foi ainda realizado um microarray de angiogénese, para detetar a expressão de outros marcadores angiogénicos nos tecidos. O processo de criopreservação não apresentou impacto na morfologia, nem na densidade folicular, proliferação e apoptose dos tecidos. Pelo contrário, a cultura de 4 horas provocou uma certa desorganização da arquitetura dos folículos. Esta não teve impacto na densidade folicular nem na apoptose, mas provocou uma diminuição na proliferação do estroma e um aumento da expressão dos genes EGF, Col4a3, Tie1 e Epas1. Nos grupos com tratamento, a maioria dos folículos era positiva para o marcador Ki-67 e a apoptose foi residual, sugerindo a viabilidade dos folículos. No entanto, foi na condição TOPC 4h+VEGF+FGF+hMG que se observou maior proliferação tanto nos folículos como no estroma; pelo que será neste grupo onde o estroma terá maior competência para suportar o desenvolvimento dos folículos, e estes maior capacidade de crescimento e de desenvolvimento. Não foram encontradas diferenças na densidade vascular, indicando que 4 horas de cultura não foram suficientes para que se observassem alterações visíveis ao nível das células endoteliais. Após as 48 horas de cultura, o tecido apresentou-se totalmente degradado mostrando que não será uma boa escolha temporal para as condições de cultura utilizadas. Futuramente, seria necessário realizar o transplante dos enxertos para confirmar se os fatores utilizados melhoram de facto a função do tecido criopreservado. Será ainda importante rever quais os timepoints a utilizar e reajustar o modelo da cultura de forma a aumentar a sobrevivência do tecido.

Ovarian cortical tissue cryopreservation is one of the procedures to preserve the fertility of young women at reproductive age and prepubertal girls. This technique is currently being accepted as a routine procedure, yet, graft survival and lifespan is limited by the initial induced ischemia.This study evaluated the effect of an in vitro pre-treatment with the angiogenic factors, VEGF (vascular endotelial growth factor) and bFGF (basic fibroblast growth factor) together with hMG (human menopausal gonadotropin) in the promotion of initial angiogenesis in rat cryopreserved ovarian tissue.For this purpose, tissues were studied in different conditions: immediately after ovariectomy (TOF 0h), after thawing of slow cryopreserved tissue (TOPC 0h) and cryopreserved samples after a 4-hour culture without any supplementation, with VEGF and FGF (TOPC 4h+VEGF+FGF), or with only hMG (TOPC 4h+hMG) or finally with all the 3 molecules (TOPC 4h+VEGF+FGF). The impact of these factors was accessed in terms of follicular density, tissue integrity, tissue proliferation and apoptosis using Ki-67 and AC-3 staining, respectively, and vascular density by factor VIII staining. An angiogenic microarray was performed to detect other angiogenic factors expression in the tissue. Slow cryopreservation did not affect tissue morphology, proliferation, apoptosis or follicular density. The 4-hour culture caused some follicle architecture disarrangement and a diminished stroma proliferation. Yet it had no impact in follicle density and in apoptosis. This condition also triggered an upregulation of EGF, Col4a3, Tie1 e Epas1 gene expression. In the treatment groups, most of the follicles were positively stained with Ki-67 and the staining with AC-3 was residual, which can be an indication of follicular viability. The TOPC 4h+VEGF+FGF+hMG group reveal a higher proliferation rate both in follicles and stroma, theoretically indicating a higher stroma ability to support follicular development and an increase capacity for follicle growth.No differences were found in vascular density between treatments groups, showing that an in vitro culture for 4 hours is not enough for visible changes in endothelial cells. After a 48-hour culture, the tissue presented a high level of degradation, indicating that this is not an adequate time point for these culture conditions, and possibly not relevant therapeutically.In the future, it would be important to transplant samples in order to confirm the present results. It is also important to re-adjust the culture model to increase tissue survival.