CRISPR-mediated pre-transcriptional silencing of ATXN3, the gene involved in Machado-Joseph disease

Abstract

Ataxia espinocerebelosa do tipo 3 (SCA3) ou doença de Machado-Joseph (MJD) é uma doença neurodegenerativa e descrita como como a forma mundialmente mais comum de ataxia com hereditariedade autossómica dominante. Pertencendo ao grupo das doenças de poliglutaminas, SCA3 é causada por uma expansão anormal de uma repetição de trinucleótidos CAG (que codificam glutamina) no exão 10 do gene ATXN3, afectando maioritariamente áreas anteriores do cérebro, tais como o cerebelo, o tronco cerebral e a parte superior da espinal medula.A progressão implacável da MJD e a sua falta de tratamento deram origem ao desenvolvimento de uma miríade de estratégias terapêuticas promissoras, incidindo em diferentes alturas da patogénese da doença, muitas delas usando tecnologia de RNAi. Usando uma estratégia específica apenas para o alelo mutante, alguns estudos foram já capazes de silenciar a forma expandida da ataxina-3 e evitar outros patogénicos mais a jusante. Os resultados destes estudos têm sido altamente promissores, tendo sido capazes de abolir tanto neuropatologia como o resgate do fenótipo normal de coordenação motora em diferentes modelos animais da doença. No entanto, estratégias de RNAi possuem desvantagens inerentes, a maior das quais sendo a sua possível toxicidade para as células, devido ao sequestro de proteínas e saturação da maquinaria enzimática de RNAi endógena. Uma estratégia incidindo num gene a um nível pré-transcripcional, permitiria uma estratégia de silenciamento de um gene fundamentalmente mais segura, permitindo evitar tanto a potencial toxicidade destas estratégias de RNAi e do mRNA mutado do gene ATXN3, como evitar processos patogénicos mais a jusante . Este tipo de estratégias podem utilizar técnicas mais recentes de edição génica, tendo por base o uso de nucleases programáveis, como a tecnologia CRISPR.Sendo uma tecnologia de desenho muito simples e de flexibilidade extrema, com um baixo custo associado, a tecnologia CRISPR permite edição génica rápida e precisa. A sua flexibilidade permitiu o aparecimento de diferentes variantes da técnica, cada uma com usos especializados: CRISPR pode ser usada para silenciar genes através de cortes em DNA (com formações de indels), para correção de mutações ou para modulação via complexos CRISPR cataliticamente inactivos e fundidos com repressores ou indutores de transcrição (CRISPRi).Neste trabalho, propomos usar a variante CRISPRi para obter silenciamento pré-transcripcional, tanto in vitro como in vivo, do gene ATXN3 humano. Para tal, propomos o uso de uma Cas9 cataliticamente inactiva fundido com um repressor transcripcional (neste caso a caixa Krüppel-associada, ou KRAB), para permitir silenciamento sem perda de informação genómica, permitindo assim uma estratégia mais segura quando comparada com estratégias clássicas de RNAi, visto que permitirá evitar toxicidade associada com mRNA mutante do gene ATXN3 mutado. Desenhámos sgRNA direccionados para diferentes áreas do gene ATXN3, tendo testado estas sequências em culturas celulares e num modelo animal trangénico da doença. De um modo geral, esta estratégia foi capaz de reduzir os níveis de ataxina-3 expandida nas culturas celulares e resultados preliminares no modelo trangénico sugerem uma melhoria da coordenação motora.

Spinocerebellar ataxia type-3 (SCA3) or Machado-Joseph disease (MJD) is a neurodegenerative disorder, described as the most common form of dominantly inherited ataxia worldwide. Being a polyglutamine disease, SCA3 is caused by an abnormal expansion of CAG trinucleotide repeat (coding for glutamine) in exon 10 of the ATXN3 gene and affects mainly the areas of the hindbrain, such as the cerebellum, brainstem and the upper part of the spinal cord.MJD relentless progression and lack of treatment have given rise to the development of a plethora of different potential and promising therapeutic approaches, many of which use RNAi technology. By using an allele-specific strategy to target the mutant allele alone, some studies have been able to silence expanded ataxin-3 and avoid downstream pathogenic processes. The results have been extremely promising, with the abolishing of neuropathology and rescue of normal gait and motor coordination. Despite this, RNAi strategies have inherent disadvantages, the greatest of which is its possible toxicity for the cell due to the sequestration of proteins or transcription factors and saturation of the endogenous enzymatic machinery of RNAi. An approach targeting a gene on a pre-transcriptional level would allow for a safer gene silencing strategy, when compared to the classical RNAi approaches, since it would avoid both more downstream pathological events and possible toxicity originating from both these RNAi strategies and mutant ATXN3 mRNA. This can be achieved with current gene editing tools, using as a basis the use of programmable nucleases, one of which being CRISPR technology.Being an extremely flexible and easily designable technology, with a low associated cost, CRISPR technology allows for relatively quick and precise gene targeting. Its flexibility has given rise to several variants of the technology, each with a specialized use: CRISPR can be used from gene silencing via DNA cleavage, to correcting mutations and to gene silencing through a chemically inactive CRISPR complex fused with a transcription repressor.In this work, we proposed to use a variant of the CRISPR editing system, termed CRISPR interference, to achieve pre-transcriptional silencing, both in vitro and in vivo, of the human ATXN3 gene. Eliciting this effect will be done via the use of a chemically inactive, or dead, Cas9, fused with a transcriptional repressor (in this case the Krüppel-associated box, or KRAB), to allow for gene silencing without loss of genome information. We have designed sgRNA directed towards areas of the ATXN3 gene and tested these sequences both in cells and in a transgenic animal model of the disease. This approach was capable of reducing the levels of ataxin-3 in cell cultures and preliminary results from the animal model suggest an improvement in motor coordination.