Exploring Japonese quail immune repertoires for antibody discovery

Abstract

Avian hosts are widely used for generation of antibodies and enable scalable and cost-effective production in eggs. Notably, hens also enable accelerating monoclonal antibody (mAb) discovery in biopharmaceutical industry since: 1) their phylogenetic distance from mammals ensures generation of robust and specific antibodies against conserved mammalian proteins and 2) the preparation of combinatorial phage-display libraries from chicken sources is simplified over mammalian systems. The present work has explored the potential of Japanese quail (Coturnix japonica) immune repertoires for mAb development. Multiple sequence search and analysis tools were used to revisit C. japonica genome (available since 2013) and identify/characterize genetic regions encoding for the light (LC) and heavy chain (HC) of quail immunoglobulin (Ig), namely using chicken data as reference.We were able to identify two main regions, corresponding to genes encoding quail Ig LC and HC. Simultaneously and supporting the genetic analysis, protein structural homology model predictions also allowed to identify folding conservation within certain domains, when comparing quail and chicken Igs. These supported the design of specific oligonucleotides that were subsequently used in PCR amplification of antibody fragments from a spleen cDNA samples, obtained from hyperimmune birds. Finally, preliminary NextGen sequencing (NGS) analysis of the fragments confirmed the expected distribution of conserved and variable regions.The present study is a relevant contribution for the implementation of methodologies that will allow generation of synthetic immunological repertoires from C. japonica hosts and subsequent development of therapeutic monoclonal antibodies.

A utilização de Aves como animal hospedeiro para geração de anticorpos é uma abordagem largamente explorada, que permite uma produção de anticorpos de baixo custo e escalável em ovos de aves poedeiras. Notavelmente, as galinhas também permitem acelerar a descoberta de anticorpos monoclonais (mAb) na indústria biofarmacêutica, uma vez que: 1) a sua distância filogenética em relação a mamíferos assegura a geração de anticorpos robustos e específicos contra proteínas conservadas de mamíferos e 2) a preparação de bibliotecas combinatórias de Phage-Display a partir de repertórios imunológicos de galinhas é simplificada em comparação com sistemas de mamíferos. O presente trabalho focou-se no estudo do potencial de repertórios imunológicos de codorniz japonesa (Coturnix japonica) no desenvolvimento de mAb. Foram utilizadas nomeadamente múltiplas ferramentas de busca e análise de sequências, para revisitar o genoma da C. japonica (disponível desde 2013) e identificar / caracterizar regiões genéticas que codificam a cadeia leve (LC) e pesada (HC) da imunoglobulina (Ig) de codorniz, usando dados de Galinha (Gallus gallus) como referência. Neste trabalho identificamos duas regiões análogas aos genes que codificam a a LC e HC da Ig de codorniz. Simultaneamente, e suportando a análise genética, previsões do modelo de homologia estrutural das proteínas codificadas por estes genes, permitiram identificar a conservação na estrutura dos domínios da Ig, entre a codorniz e a galinha. Estas análises permitiram o desenho de oligonucleótidos que foram subsequentemente utilizados na amplificação por PCR dos fragmentos de anticorpo, a partir de amostras de bibliotecas de cDNA do baço previamente obtidos de aves hiperimunes. Adicionalmente, uma análise preliminar por sequenciação NextGen (NGS) destes fragmentos confirmou a distribuição esperada das regiões conservadas e variáveis características de Ig.Este estudo representa uma contribuição relevante para a implementação de metodologias que permitem a geração de repertórios imunológicos utilizando a C. japonica e o posterior desenvolvimento de anticorpos monoclonais terapêuticos.