Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10316/84735
Title: Immunocytotoxicity of Chitosan Nanoparticles: Effect of Chitosan Deacetylation Degree
Other Titles: Imunocitotoxicidade das Nanopartículas de Quitosano: Efeito do Grau de Desacetilação do Quitosano
Authors: Duarte, Alana Gabriely Reis 
Orientador: Ribeiro, Olga Maria Fernandes Borges
Keywords: Quitosano; Nanopartículas; Polímero; Imunotoxicidade; Safe-by-design; Chitosan; Nanoparticles; Polymer; Immunotoxicity; Safe-by-design
Issue Date: 23-Jul-2018
Serial title, monograph or event: Immunocytotoxicity of Chitosan Nanoparticles: Effect of Chitosan Deacetylation Degree
Place of publication or event: Faculdade de Farmácia da Universidade de Coimbra
Abstract: Nanoparticles (NPs) conquered an important role in many areas such as drug delivery. The number of studies that include them has grown in the last years. Nonetheless, the correlation between their properties and their effects on the immune system is poorly understood. Chitosan is a natural polymer that has shown interesting properties as biocompatibility and biodegradability. Considering the application of Chitosan NPs in the drug delivery field, the aim of this work was to study its immunotoxicity as a case study. On the one hand it was tried to clarify some controversial information that was found in the literature related with immunotoxicological properties of the chitosan NPs and on the other as a secondary objective to establish methods for testing immunotoxicity of the NPs that can be adapted to other nanomaterials which is important to their biomedical application and safe design. This work evaluated the Chitosan NPs toxicity in murine macrophages (RAW 264.7) and in human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). Other parameters important to the immunotoxicological assessment as the hemocompatibility were evaluated and was reported the relevance of the correct characterization of chitosan as their properties as deacetylation degree (DD) and molecular weight (MW). Chitosan NPs were produced by a coacervation method with different crosslinks: Method A with tripolyphosphate (ChitA NPs) and Method B with sodium sulphate (ChitB NPs). The average size of the ChitA NPs were 102.2 ± 8.7 nm, 133.1 ± 4.6 nm and 269.4 ± 38.5 nm with a chitosan DD of 80 %, 86 % and 93 %, respectively. With the method B, the average size of the ChiB NPs obtained were 351.7 ± 32.5 nm and 549.6 ± 12.4 nm with a chitosan DD of 80 % and 86 %, respectively. These results showed that the particle size increased with the chitosan DD and MW. Quantification studies showed that almost 100 % of chitosan was incorporated in the NPs. Stability tests were performed, and it was showed that ChitA NPs are stable at 4 ºC and 20 ºC at least for 5 weeks. The stability results in cell media showed a size increase after 24 h incubation with DMEM. In the incubation with RPMI the ChitA NPs 93 % also showed a size increase while the size of ChitA NPs decreased. Relatively to the immunotoxicological tests, the NPs showed to be more cytotoxic than the polymers in human PBMCs and in murine macrophages. An inhibitory effect of the NPs and polymers in LPS-induced NO production was observed which was more significant with the ChitA NPs with lower DD (80 %). However, without LPS, none of the concentrations of the NPs and polymers had a stimulatory effect in the NO production. The effect of chitosan in cytokine production was evaluated with two pro-inflammatory cytokines: TNF-α and IL-1β. None of the Chitosan NPs induced TNF-α, while the polymer with higher DD (93 %) showed to induce this cytokine production in a concentration-dependent manner. Both polymers and NPs were not able to stimulate the production of the IL-1β. The hemocompatibility of chitosan was also evaluated neither the NPs or polymers had hemolytic effect, but the ChitA NPs 80 % at 1mg/mL affected the plasma coagulation time by the intrinsic pathway. The effect on platelet aggregation wasn’t conclusive as during the assay, the interference of the NPs with the method was observed.These results show that the DD of chitosan and nanoparticle size can affect some immunotoxicological parameters. This work also highlights the importance of selecting appropriate methods and controls to avoid misinterpretations. These results together with further studies will contribute to develop a knowledge base and guidelines to implement the safe-by-design approach for nanobiomaterials, with focus on polymeric drug delivery systems.
As nanopartículas (NPs) conquistaram um papel importante em muitas áreas, como a entrega de fármacos. O número de estudos que as incluem tem crescido nos últimos anos. No entanto, a correlação entre suas propriedades e seus efeitos sobre o sistema imunitário é pouco compreendida. O quitosano é um polímero natural que tem mostrado propriedades interessantes tais como biocompatibilidade e biodegradabilidade. Considerando a aplicação de NPs de quitosano na área de entrega de fármacos, o objetivo deste trabalho foi estudar a sua imunotoxicidade como um caso de estudo. Por um lado, procurou-se esclarecer algumas informações controversas encontradas na literatura relacionadas às propriedades imunotoxicológicas das NPs de quitosano e, por outro, como objetivo secundário estabelecer métodos para testar a imunotoxicidade das NPs que podem ser adaptados a outros nanomateriais o que é importante para a sua aplicação biomédica e design seguro.Este trabalho avaliou a toxicidade de NPs de quitosano em macrófagos e murganho (RAW 264.7) e em células mononucleares do sangue periférico humano (PBMCs). Outros parâmetros importantes para a avaliação imunotoxicológica tais como a hemocompatibilidade foram avaliados e foi mostrada a relevância da correta caracterização do quitosano tal como suas propriedades como grau de desacetilação (DD) e peso molecular (PM). As NPs de quitosano foram produzidas por um método de coacervação com diferentes ligações cruzadas: Método A com tripolifosfato (ChitA NPs) e Método B com sulfato de sódio (ChitB NPs). O tamanho médio das NPs de ChitA foi de 102,2 ± 8,7 nm, 133,1 ± 4,6 nm e 269,4 ± 38,5 nm com um quitosano com DD de 80 %, 86 % e 93%, respetivamente. Com o método B, o tamanho médio das ChitB NPs obtidas foi de 351,7 ± 32,5 nm e 549,6 ± 12,4 nm com um quitosano com DD de 80 % e 86 %, respetivamente. Estes resultados mostraram que o tamanho das partículas aumentou com o DD e MW do quitosano. Estudos de quantificação mostraram que quase 100 % do quitosano foi incorporado nas NPs. Testes de estabilidade foram realizados, e foi demonstrado que as ChitA NPs são estáveis a 4 ºC e 20 ºC pelo menos por 5 semanas. Os resultados de estabilidade em meios celulares mostraram um aumento de tamanho após 24 h de incubação com DMEM. Na incubação com RPMI, as ChitA NPs 93 % também apresentaram um aumento de tamanho, enquanto o tamanho das ChitA NPs diminuiu. Relativamente aos testes imunotoxicológicos, as NPs mostraram ser mais citotóxicas do que os polímeros em PBMCs humanas e em macrófagos de murganho. Observou-se um efeito inibitório das NPs e polímeros na produção de NO induzida por LPS, que foi mais significativo com as ChitA NPs com menor DD (80 %). No entanto, sem o LPS, nenhuma das concentrações das NPs e polímeros teve efeito estimulante na produção do NO. O efeito do quitosano na produção de citocinas foi avaliado com duas citocinas pró-inflamatórias: TNF-α e IL-1β. Nenhuma das NPs de quitosano induziu TNF-α, enquanto o polímero com maior DD (93 %) mostrou induzir a produção de citocinas de maneira dependente da concentração. Ambos os polímeros e NPs não foram capazes de estimular a produção da IL-1β. A hemocompatibilidade do quitosano também foi avaliada, nem as NPs ou polímeros tiveram efeito hemolítico, mas as NPs de ChitA 80 % a 1mg/mL afetaram o tempo de coagulação plasmática pela via intrínseca. O efeito na agregação plaquetária não foi conclusivo, pois durante o ensaio, a interferência das NPs com o método foi observada.Esses resultados mostram que o DD do quitosano e o tamanho das nanopartículas pode afetar alguns parâmetros imunotoxicológicos. Este trabalho também destaca a importância de selecionar métodos e controlos apropriados para evitar interpretações erradas. Esses resultados, juntamente com outros estudos, contribuirão para o desenvolvimento de uma base de conhecimento e diretrizes para implementar a abordagem safe-by-design para nanobiomateriais, com foco em sistemas de entrega de fármacos poliméricos.
Description: Dissertação de Mestrado em Biotecnologia Farmacêutica apresentada à Faculdade de Farmácia
URI: http://hdl.handle.net/10316/84735
Rights: embargoedAccess
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