Please use this identifier to cite or link to this item: https://hdl.handle.net/10316/83638
Title: Identification of Neuropeptide Y receptors in human articular cartilage: influence of gender and osteoarthritis
Other Titles: Identificação dos recetores do Neuropeptídeo Y em cartilagem articular humana: influência do género e da osteoartrite
Authors: Ferreira, Inês Sofia dos Santos Rodrigues 
Orientador: Mendes, Alexandrina Maria Ferreira Santos Pinto
Cavadas, Cláudia Margarida Gonçalves
Keywords: Cartilagem articular humana; Neuropeptídeo Y; Osteoartrite; Recetores; Human articular cartilage; Neuropeptide Y; Osteoarthritis; Receptors
Issue Date: 28-Jul-2017
Project: info:eu-repo/grantAgreement/FCT/5876/147358/PT 
Serial title, monograph or event: Identification of Neuropeptide Y receptors in human articular cartilage: influence of gender and osteoarthritis
Place of publication or event: FFUC e Centro de Neurociências e Biologia Celular da Universidade de Coimbra
Abstract: A osteoartrite (OA) é uma doença degenerativa que afeta as articulações sinoviais e que gera rigidez e dor articulares, culminando na perda de mobilidade articular e na diminuição da qualidade de vida. No entanto, não há atualmente intervenções terapêuticas capazes de regenerar ou de reparar a cartilagem articular degradada ou de, pelo menos, adiar o desenvolvimento e a progressão da OA. Fibras nervosas sensoriais e simpáticas com origem no sistema nervoso periférico inervam vários tecidos articulares. Aparentemente, modificações nesta inervação articular periférica contribuem para o surgimento de alterações degenerativas que induzem a progressão da OA. Vários tipos de células residentes do sistema músculo-esquelético expressam recetores para neurotransmissores sensoriais e simpáticos e algumas destas células sintetizam também os próprios neurotransmissores. O neuropeptídeo Y (NPY) atua como um neurotransmissor e está amplamente distribuído nos sistemas nervosos central e periférico. Neste último, é detetado em fibras nervosas simpáticas. Notavelmente, níveis elevados de NPY foram detetados em articulações osteoartríticas. Contudo, ao contrário do que sucede com outros neurotransmissores e respetivos recetores, não há estudos que descrevam a presença de recetores do NPY na cartilagem articular e o papel deste neuropeptídeo nas funções dos tecidos articulares ainda não foi elucidado. Assim, este estudo teve como primeiro objetivo determinar se e quais os subtipos de recetores do NPY (Y1, Y2 e Y5) presentes em condrócitos humanos e em cartilagem articular humana. A presença de cada subtipo de recetor foi investigada por imunofluorescência com anticorpos primários contra os recetores do NPY, Y1, Y2 e Y5, na linha celular condrocítica humana, C28/I2, e em cortes de cartilagem humana saudável e osteoartrítica. Na linha celular condrocítica, foi observada imunoreatividade para os recetores do NPY Y1, Y2 e Y5. Em cartilagem articular humana, apenas o recetor Y2 foi encontrado em todas as amostras e o recetor Y5 não foi detetado em nenhuma das amostras. Por outro lado, a imunoreatividade para o recetor Y1 foi observada em amostras de cartilagem de mulheres e de homens com OA, assim como em amostras de cartilagem de mulheres saudáveis, mas não nas de homens saudáveis. De seguida, pretendeu avaliar-se se os subtipos de recetores do NPY identificados são funcionais. Sabe-se que a atividade autofágica basal diminui tanto com o envelhecimento como com a OA e que o papel protetor da modulação da autofagia em doenças articulares associadas à idade tem sido defendido. Além disso, determinou-se que o NPY estimula a autofagia no hipotálamo de roedores e que pode ter um efeito protetor contra o envelhecimento. Desta forma, o objetivo seguinte deste estudo foi determinar se o NPY conseguia induzir este efeito estimulatório na autofagia em condrócitos humanos. Para isso, a linha celular condrocítica humana, C28/I2, foi utilizada e a razão entre os níveis de LC3-II e I, um marcador da ativação da autofagia, foi comparada através de análise de Western Blot na presença ou na ausência de um inibidor da degradação lisossomal de proteínas, a cloroquina (ChQ).Para assegurar que o NPY e a ChQ não tinham efeitos citotóxicos nos condrócitos humanos, foram realizados à priori ensaios de viabilidade celular. Os resultados obtidos demonstraram que, sob as condições experimentais utilizadas, nenhum dos compostos afetou a viabilidade celular em comparação com as células não tratadas. A análise de Western Blot indicou que na estimulação de 6 horas com NPY 50 nM ou 100 nM parece haver um aumento médio do fluxo autofágico relativamente às células controlo, que não alcançou significância estatística, provavelmente devido à variabilidade verificada entre ensaios. O tratamento com NPY durante 24 horas, especialmente na concentração de 100 nM, também parece aumentar o fluxo autofágico, apesar de não poderem ser retiradas conclusões, pois estes são apenas resultados preliminares, que não permitiram que a análise estatística fosse realizada. Em suma, este estudo mostra que recetores do NPY estão presentes em células condrocíticas humanas e em condrócitos humanos in situ na cartilagem articular. Além disso, a expressão dos subtipos de recetores do NPY parece ser determinada pelo sexo e, em homens, também pelo grau de OA, sugerindo fortemente que células não neuronais, nomeadamente os condrócitos, e tecidos das articulações são relevantes como alvos do NPY. São necessários estudos futuros para compreender o papel do NPY e dos seus recetores na modulação da autofagia em condrócitos, em mulheres e homens, e a forma como esse papel afeta a sua homeostasia em condições de saúde e de doença. Estes estudos fornecerão a base para mais estudos, que tenham como objetivo estabelecer o papel do NPY e dos seus recetores na homeostasia da cartilagem e de outros tecidos articulares, assim como no desenvolvimento e na progressão da OA.
Osteoarthritis (OA) is a degenerative synovial joint disease, which brings about joint stiffness and pain, ultimately leading to loss of joint mobility and considerably impaired quality of life. However, there are presently no therapeutic interventions capable of regenerating or repairing the degraded articular cartilage or, at least, of delaying the development and progression of OA. Sensory and sympathetic nerve fibers arising from the peripheral nervous system innervate several joint tissues. Seemingly, changes in this peripheral joint innervation contribute to the emergence of degenerative alterations that elicit OA progression. Various resident cell types of the musculoskeletal system express receptors for sensory and sympathetic neurotransmitters and some of these cells even synthesize the neurotransmitters themselves. Neuropeptide Y (NPY) acts as a neurotransmitter and is widely distributed in the central and peripheral nervous systems. In the latter, it is detected in sympathetic nerve fibers. Importantly, elevated levels of NPY were reported in osteoarthritic joints. Nevertheless, contrarily to other neurotransmitters and their receptors, no studies have depicted the presence of NPY receptors in articular cartilage, nor has the role of this neuropeptide in joint tissue functions been elucidated. This study firstly aimed at determining whether and which NPY receptor subtypes (Y1, Y2 and Y5) are present in human chondrocytes and in human articular cartilage. The presence of each receptor subtype was investigated by immunofluorescence with primary antibodies against the NPY receptors, Y1, Y2 and Y5, in the human chondrocytic cell line, C28/I2, and in healthy and osteoarthritic human cartilage sections. Immunoreactivity for Y1, Y2 and Y5 NPY receptors was observed in the chondrocyte cell line. In human cartilage, only the Y2 receptor was found in all samples and Y5 receptor immunoreactivity was undetectable in all samples. On the other hand, Y1 receptor immunoreactivity was observed in male and female OA cartilage samples, as well as in those from healthy females, but not in those from healthy males. Hereafter, this study intended to assess whether the NPY receptor subtypes identified are functional. Notably, basal autophagic activity diminishes both with aging and OA and the protective role of autophagy modulation in age-associated joint diseases has been advocated. Furthermore, NPY was found to stimulate autophagy in rodent hypothalamus and to possibly have an aging-protective effect. Thus, this study aimed at determining whether NPY could induce this same stimulatory effect in human chondrocytes. To achieve this, the human chondrocytic cell line, C28/I2, was used and the ratio between the levels of LC3-II and I, a marker of autophagy activation, was compared by Western Blot analysis in the presence or absence of the lysosomal protein degradation inhibitor, chloroquine (ChQ). To assure that NPY and ChQ did not have cytotoxic effects to human chondrocytes, cell viability assays were foremost carried out. The results obtained demonstrated that, under the experimental conditions used, none of the compounds affects cell viability in comparison with control untreated cells. Western Blot analysis indicated that in a 6-hour stimulation with NPY 50 nM or 100 nM, there seems to be a mean increase of the net flux relative to control cells, which did not reach statistical significance, likely due to the observed inter-assay variability. Treatment with NPY for 24h, especially at the 100 nM concentration, also seems to increase the net flux, even though no conclusions can be taken, as these are preliminary results that did not allow statistical analysis to be performed. As a whole, this study shows that NPY receptors are present in human chondrocytic cells and in human chondrocytes in situ in the articular cartilage. Moreover, the expression of the NPY receptor subtypes seems to be determined by gender and, in males, also by the disease state, strongly suggesting that non-neuronal cells and tissues of the joints, namely chondrocytes, are relevant as NPY targets. Future studies are required to understand the role of NPY and its receptors in modulating male and female chondrocyte autophagy and how it affects their homeostasis in health and disease conditions. These studies will provide the basis for further studies aimed at establishing the role of NPY and its receptors in cartilage and other joint tissues health and in OA development and progression.
Description: Dissertação de Mestrado em Farmacologia Aplicada apresentada à Faculdade de Farmácia
URI: https://hdl.handle.net/10316/83638
Rights: openAccess
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