Natural variation in the response to chemically induced shoot regeneration in Arabidopsis thaliana (L.) Heynh

Abstract

Plants are able to regenerate new organs from differentiated tissues cultivated in vitro. Adventitious shoot organogenesis has applications in plant transformation and in vitro propagation. In Arabidopsis thaliana, this can be achieved using root explants trough a two-step protocol, where new shoot meristems are induced by the conversion of lateral root-like primordia. However, this capacity is highly variable among natural accessions. Thus, the goal of this work was to gain insight into the phenotypic and genetic variation across a range of wild type Arabidopsis accessions with respect to shoot regeneration from root explants and to identify genetic factors involved in chemically enhanced shoot regeneration.To this end, 190 Arabidopsis accessions were analysed for their shoot regeneration capacity using two protocols, that reflect the most suitable conditions for C24 and Col-0 accessions, and in the presence and absence of an enhancer of shoot regeneration, here called compound C1. High variability was observed in the identity and number of structures formed and in the response to C1 among the different accessions tested, that ranged from recalcitrant to highly responsive ones. C1 was shown to promote shoot induction since its effect was positive in almost all accessions. Also, the conditions of Col-0 protocol proved to be more efficient, resulting both in a higher shoot regeneration index and a higher induced shoot numbers per explant than those of C24 protocol for most of the accessions. However, Lp2-2, Kar-1, Kyoto, Cen-0, C24, Bla-1, Gel-1, Etna-2 and Sapporo-0 had a regeneration rate higher than 90% in the presence of C1, regardless of the protocol used.Genome-Wide Association analyses revealed the occurrence of genetic variations (SNPs) associated with the differences in shoot regeneration phenotype and the response to C1. From these genetic variations, a large list of candidate genes was deduced, reflecting the complexity and broad polygenic basis of shoot regeneration. Nevertheless, five genes are noteworthy: WUS, ACS10, ERF061, MIR167C and IPS1. The finding of WUS – a gene commonly known to be important in the regenerative capacity – proved the veracity of this approach, while the discovery of ethylene-related genes ACS10 and ERF1 provides an incentive for the hypothesis that ethylene is involved in shoot regeneration, which has already been reported as well. MIR167C and IPS1, that regulates the activity of other miRNA, are also noteworthy genes since other miRNAs have been shown required for in vitro shoot regeneration. Furthermore, genetic variations around WUS, ACS10 and IPS1 were found to be associated with shoot regeneration from root explants in Arabidopsis regardless of the specific conditions that plants were subjected to, meaning that they are likely causal genes. Thus, our results suggest that changes in WUS, miRNAs and ethylene signalling or homeostasis might be responsible for the variation observed in the regenerative capacity and that C1 might boost this capacity by modulating these factors/processes. Nevertheless, all candidate genes need validation to know whether they are indeed causal genes. That can be done by gene knock-outs, complementation tests and/or using the CRISPR/Cas9 tool, a method for targeted genetic engineering by which a good allele can be inserted into a poorly performing background and see whether it improves regeneration.

As plantas podem regenerar novos órgãos a partir de tecidos diferenciados cultivados in vitro. A indução de organogénese é um processo com muitas aplicações na transformação genética de plantas e na propagação in vitro. Em Arabidopsis thaliana, isso pode ser conseguido usando explantes radiculares através de um protocolo de dois passos, onde novos meristemas caulinares são induzidos a partir de primórdios das raízes laterais. No entanto, esta capacidade é altamente variável entre genótipos. Assim, o principal objetivo deste trabalho foi analisar de que forma explantes radiculares de genótipos selvagens de Arabidopsis respondem à indução de organogénese e identificar fatores genéticos envolvidos na regeneração de rebentos potenciada por um composto químico em estudo.A resposta organogénica foi testada em 190 genótipos de Arabidopsis usando dois protocolos que refletem as condições mais adequadas para os genótipos C24 e Col-0, na presença e ausência de um potenciador da regeneração de rebentos: composto C1. Os resultados mostraram uma alta variabilidade no tipo e no número de estruturas formadas e na resposta ao C1 entre os diferentes genótipos testados, que variaram de linhas recalcitrantes a linhas com uma elevada resposta. Nas condições testadas, o composto C1 mostrou ser promotor da indução de rebentos, pois o seu efeito foi positivo em quase todos os genótipos. Além disso, as condições do protocolo Col-0 provaram ser mais eficientes pois resultaram num maior índice de regeneração de rebentos e induziram um maior número de rebentos por explante do que as do protocolo C24 para a maioria dos genótipos. Contudo, Lp2-2, Kar-1, Kyoto, Cen-0, C24, Bla-1, Gel-1, Etna-2 e Sapporo-0 apresentaram uma taxa de regeneração maior que 90% na presença de C1, independentemente do protocolo usado.As análises de genome-wide association revelaram muitas variações genéticas (SNPs) associadas a diferenças na regeneração de rebentos e à resposta ao C1. A partir dessas variações genéticas, uma lista grande de genes candidatos foi deduzida, refletindo a complexidade e a ampla base poligénica envolvida na regeneração de rebentos. Ainda assim, há cinco genes que merecem destaque: WUS, ACS10, ERF061, MIR167C e IPS1. O envolvimento de WUS - um gene comummente conhecido por ser importante na capacidade regenerativa - provou a veracidade desta abordagem, enquanto a descoberta de genes relacionados com a ação do etileno, ACS10 e ERF061, sugere que esta hormona possa estar envolvida na regeneração de rebentos, à semelhança do que é referido em alguns artigos. MIR167C e IPS1, que regula a atividade de outro miRNA, são também de destacar uma vez que outros miRNAs têm-se mostrado necessários para a regeneração de rebentos in vitro. Além disso, variações genéticas em redor dos genes WUS, ACS10 e IPS1 apresentaram-se associadas com a regeneração de rebentos através de explantes radiculares em Arabidopsis independentemente das condições a que as plantas foram sujeitas, significando que estes são provavelmente genes causais. No seu conjunto, os resultados obtidos sugerem que mudanças em WUS, miRNAs e na sinalização ou homeostase do etileno podem ser responsáveis pela variação observada na capacidade regenerativa e que C1 poderá aumentar essa capacidade modulando estes fatores/processos. Estes dados necessitam de confirmação futura de maneira a verificar se os genes candidatos são realmente genes causais. Esta validação pode ser feita por eliminação de genes, testes de complementação e/ou usando a abordagem CRISPR/Cas9, um mecanismo de edição genética que permite, por exemplo, inserir um bom alelo num background de pouca performance e ver se ele afeta positivamente a organogénese.