Breaking the ctDNA sensitivity barrier

Abstract

Over the years, advances in the molecular and biological understanding of cancer has changed the paradigm of clinical practice from a systematic to a personalized and targeted therapeutic approach. However, an accurate molecular characterization of the tumor is only achieved through tissue biopsy, an invasive strategy that comprises many limitations. In this context, liquid biopsy, peripheral blood sample, comes as an alternative. Technological advances for detection and characterization of tumor-specific mutations in plasma have revealed its potential clinical relevance as biomarkers for tumor detection, response to therapy and disease follow-up. Despite the exciting breakthroughs, the intrinsic low abundance of circulating tumor DNA (ctDNA) makes the detection of such mutations in plasma a challenging task. This problem has been tackled by the development of high sensitive technologies but their complexity makes them difficult to implement in clinical routine. In alternative, our hypothesis was that pre-treatment of patients with cytotoxic drugs could increase the levels of ctDNA allowing the use of routine methodologies for the detection of tumor derived mutations in plasma. The major goal of this study was to test the effect of cytotoxic chemotherapeutic drug treatment on the levels of ctDNA. More specifically, we aimed to determine the effective therapeutic concentration with effect on ctDNA release and the ideal time point for blood collection after treatment. In order to address our hypothesis, in vitro assays were performed in lung cancer cell lines to establish the dose and time dependent effect of widely used cytotoxic chemotherapeutics. Liquid biopsies strategies were adopted to assess the effect of single drug treatment in DNA release levels both in vitro and in vivo using xenografted mice models. Additionally, identification of ctDNA was achieved through the detection of specific sequences of DNA derived from the plasma of xenografted mice.The results have shown that docetaxel was the most effective drug to reduce cell viability. This effect correlated to significant increase levels of late apoptosis in cells 48h after treatment with docetaxel. Additionally, in vitro drug treatment induced an increase in ctDNA release levels, with a greater effect at the 48h time point, suggesting an impact of docetaxel in cfDNA release. In vivo, a single dose treatment of docetaxel (25 mg/Kg) resulted on increased tumor apoptosis at 48h which correlates with increased levels of cfDNA detected in plasma. The specific detection of increased levels of tumor-derived DNA confirmed the influence of docetaxel treatment on ctDNA release. Furthermore, xenograft mice treated with docetaxel revealed increased mutational load when compared to untreated conditions, where the mutation was not detected. Despite preliminary, these findings provide evidence that a single treatment with docetaxel approximately 48h prior to liquid biopsy, in vivo, can contribute to higher levels of ctDNA and consequently overcome the problem of low sensitivity of detection. Moreover, the present work indicate apoptosis as the major release mechanism of ctDNA. Altogether, this study provided new insights into a novel strategy which might accelerate the implementation of ctDNA detection as a liquid biopsy strategy on the clinical routine and have an impact on clinical management of patients.

O estudo da biologia molecular do cancro tem permitido avanços científicos com impacto na prática clínica, mudando o paradigma de abordagem terapêutica convencional, sistémica, para uma abordagem personalizada. No entanto, a caracterização molecular de tumores sólidos só é possível através da biopsia do tecido, uma estratégia altamente invasiva com diversos riscos e limitações associadas. Neste contexto, a biopsia líquida, colheita de sangue, surge como uma alternativa. Avanços tecnológicos para deteção e caracterização de mutações específicas do tumor presentes no plasma permitiram a descoberta da relevância clínica do ADN circulante como biomarcador no diagnóstico, resposta a terapia e monitorização da doença. Apesar destas descobertas, a baixa abundância do ADN tumoral em circulação torna difícil a deteção de mutações relevantes. Estratégias para a resolução deste problema incluem o desenvolvimento de novas metodologias, mais sensíveis, para a deteção de mutações raras. No entanto estas estratégias são ainda muito complexas e dispendiosas para serem aplicadas na prática clínica. Assim, a nossa hipótese é que o pré-tratamento dos pacientes com quimioterápicos poderá aumentar os níveis de ADN tumoral em circulação permitindo o uso das metodologias disponíveis para deteção, no plasma, de mutações derivadas do tumor. O principal objetivo desta dissertação foi testar o efeito do uso de quimioterápicos nos níveis de ADN tumoral circulante de forma a ultrapassar a baixa sensibilidade de deteção das metodologias disponíveis na clínica. Especificamente, determinamos a dose terapêutica efetiva com impacto nos níveis de ADN circulante e o momento ideal para realização da biopsia líquida após tratamento de forma a maximizar a deteção de ADN tumoral circulante.Foram realizados ensaios em linhas celulares de cancro do pulmão de forma a determinar o efeito da concentração e do tempo do tratamento com quimioterápicos usados na prática clínica. De modo a determinar o efeito do tratamento com docetaxel na libertação de ADN circulante, estratégias de biopsia líquida foram aplicadas tanto in vitro como in vivo. Por fim, a deteção de ADN tumoral circulante foi feita com a utilização de sondas específicas para sequências de interesse do ADN tumoral.Verificámos que o docetaxel foi o quimioterápico mais eficiente a reduzir a viabilidade celular, o que foi concordante com o aumento dos níveis de apoptose verificados 48h após tratamento. Os níveis aumentados de ADN circulante, observados in vitro, após 48h de exposição ao docetaxel, sugerem o impacto do tratamento nos níveis de apoptose e consequentemente na quantidade de ADN circulante. In vivo, o tratamento com uma dose de docetaxel (25 mg/Kg) provocou o aumento dos níveis de apoptose 48h após tratamento, um aumento que também se verificou relativamente aos níveis de ADN circulante. Especificamente, foi possível detetar níveis aumentados de ADN proveniente do tumor no plasma de ratinhos tratados com docetaxel, quando comparado com ratinhos não tratados. Foi detetado um aumento na sensibilidade de deteção da mutação específicas do tumor no plasma de ratinhos após tratamento com docetaxel, o que não se verificou para os animais não tratados.Este estudo apresenta evidências preliminares de que uma dose única de docetaxel 48h antes da realização de biopsia líquida, in vivo, pode contribuir para o aumento dos níveis de ADN em circulação e consequentemente, ultrapassar o problema de sensibilidade de deteção de mutações raras. Neste estudo também foi possível verificar a importância do processo de apoptose como um mecanismo de libertação de ADN tumoral. Esta estratégia inovadora poderá agilizar a aplicação da deteção de ADN circulante (biopsia líquida) como biomarcador, na prática clínica, para a monitorização do cancro.