CD96 (TACTILE), CD226 (DNAM-1) and TIGIT in the regulation of immune functions in chronic myeloid leukemia

Abstract

Chronic Myeloid Leukemia (CML) is a clonal myeloproliferative disease characterizedby the presence of the Philadelphia chromosome (Ph+) and its oncogenic product, BCR-ABL,a constitutively active tyrosine kinase. The BCR-ABL mediates the phosphorylation of severalsubstrates, resulting in altered cellular adhesion, inhibition of apoptosis and activation ofmitogenic signaling. The tyrosine kinase inhibitors (TKIs) are the standard treatment for CML.Natural killer (NK) cells and CD8+ T cells are cytotoxic lymphocytes that possessimportant antitumor cytotoxicity and can act on oncoproteins in CML patients. These cellsexpress a variety of activating and inhibitory receptors in their surface that control their activityand facilitate the discrimination between damage and healthy cells. Among them, a new groupof immunoglobulin-superfamily members that interact with ligands of nectin and nectin-likefamily have emerged and have been described as important regulators of NK and T cellsfunctions. Those include CD96, TIGIT and CD226. CD226 activates the NK and T cellmediatedcytotoxicity, whereas TIGIT and CD96 reportedly counterbalance that activation.These receptors have been implied in the development of different pathologies, such asinfections, autoimmune disorders and cancer, specifically in acute and myeloid leukemia. Thereare not yet published studies referring to the direct relationship between the expression ofCD96, CD226 and TIGIT, and the development of chronic myeloid leukemia.The major goal of this study was to understand the role of CD96, TIGIT and CD226in different immune cells of CML patients. By ex vivo flow cytometry analysis, the expression ofthese receptors was analyzed in NK cells, NKT-like and CD8+ T cells of 31 CML patients withdifferent clinical characteristics. It was showed that the expression of CD96, TIGIT and CD226is not altered in NK cells from CML patients. Moreover, this expression was influenced by thepercentage of Ph+ CML cells. Naïve patients (higher percentage of Ph+ CML cells) presented anincrease in TIGIT expression and a decrease in CD226 expression. After treatment (lowerpercentage of Ph+ CML cells), both levels were normalized. NKT-like cells from CML patientsshowed an increase in CD226 expression and CD8+ T cells revealed an increase in TIGIT andCD226 expression.Additionally, in vitro blockade studies were performed and revealed that the CD96 andTIGIT block was capable of increase the cytotoxic potential of NK cells, NKT-like cells andCD8+ T cells, through the increase in the CD107a, interferon-gamma (IFN-γ) and Granzyme Blevels. Moreover, when comparing to healthy donors (HD), these cells presented similar levelsof CD107a and IFN-γ but significant lower levels of Granzyme B. Additionally, a NK-TVAwas performed to assess the NK cell-mediated killing. It was showed that effector function ofNK cells from CML patients is impaired. Although the CD107a, IFN-γ and Granzyme B levelswere increased with the blockades, the NK cells from CML patients present lower percentagesof killing when compared to HD. Furthermore, the CD226 blockade do not have any effectover the CD107a, IFN-γ and Granzyme B levels although it greatly impaired the NK cellmediatedkilling.This study shows the importance of blocking CD96 and TIGIT to enhance thecytotoxicity mediated by NK cells from CML patients. Although there are some answeredquestions, the existing data suggests that CD226/CD96/TIGIT axis, and its ligands may be avery interesting target to the development of a new anti-cancer immunotherapy.

A Leucemia Mieloide Crónica (LMC) é uma doença proliferativa caracterizada pela presença do cromossoma Filadélfia e do seu produto oncogénico, BCR-ABL, que possui uma atividade constitutiva de tirosina cinase. Esta proteína leva à fosforilação de diversos substratos, resultando em alterações na adesão e divisão celular e inibição da apoptose. Atualmente, o tratamento standard para LMC são os inibidores de tirosina cinase. As células natural killer (NK) e as células T CD8+ são linfócitos citotóxicos que possuem uma importante atividade anti-tumoral e são capazes de atuar sobre as oncoproteinas dos pacientes com LMC. À sua superfície, estas células possuem uma variedade de recetores ativadores e inibitórios que controlam a sua atividade e permitem a distinção entre células saudáveis e células alteradas. Os membros de um grupo de receptors da superfamília das imunoglobulinas têm sido apontados como importantes reguladores das funções das células NK e T. Este grupo inclui o CD96, o T cell immunoreceptor with immunoglobulin and ITIM domains (TIGIT) e o CD226. O CD226 potencia a atividade citotóxica das células NK e T, enquanto que o CD96 e TIGIT contrabalançam essa ativação. Já foram associadas alterações na expressão destes recetores e o desenvolvimento de diversas doenças, como infeções, doenças autoimunes e cancro, nomeadamente leucemias agudas e mieloides. No entanto, ainda não existem estudos que estabeleçam uma relação entre estes o CD96, TIGIT e CD226 e o desenvolvimento da LMC. O principal objetivo do presente trabalho foi estudar o papel do CD96, TIGIT e CD226 em diferentes células do sistema imune de doentes com LCM. Recorrendo a citometria de fluxo, foi analisada, ex vivo, a expressão dos recetores em células NK, NKT-like e T CD8+ de doentes com LCM que apresentavam diferentes características clínicas. Verificou-se que a expressão dos recetores não se encontrava alterada nas células NK. Além disso, concluiu-se também que a percentagem de células positivas para o cromossoma Filadélfia influenciava esta expressão. Pacientes naïve (elevada percentagem de Ph+) apresentavam um aumento da expressão do TIGIT e uma diminuição da expressão do CD226 enquanto que os doentes em tratamento (percentagem mais baixa de Ph+) apresentavam estes níveis normalizados. Relativamente às células NKT-like, verificou-se um aumento da expressão de CD226. Este aumento foi também verificado nas células T CD8+, assim como um aumento na expressão do TIGIT.Foram também realizadas experiências de bloqueio, in vitro. Verificou-se que o bloqueio do CD96 e TIGIT tinha um efeito positivo sobre o potencial citotóxico das células NK, NKT-like e T CD8+ de doentes, através do aumento dos níveis de CD107a, interferão-gama (IFN-γ) e granzima B. Apesar de os doentes apresentarem níveis de CD107a e IFN-γ similares aos de dadores saudáveis, os níveis de granzima B encontravam-se significativamente mais baixos. De seguida, realizou-se um NK-TVA para medir a morte mediada pelas células NK. Aqui, verificou-se que as células NK de doentes matavam menos do que as células de dadores. Além disso, verificou-se que o bloqueio do CD226 não interferia com os níveis de CD107a, IFN-γ e granzima B, mas prejudicava de forma severa a morte mediada pelas células NK. Este estudo demonstra a importância de bloquear o CD96 e TIGIT para aumentar o potencial citotóxico das células NK de doentes. Apesar de ainda existirem algumas questões em aberto, os dados existentes sugerem que as interações CD96/TIGIT/CD226 e os seus ligandos poderão ser um alto interessante para se desenvolver uma nova imunoterapia anti-tumoral.