Role of astrocytes in synaptic function and memory. Focus on adenosine A2A receptors.

Abstract

Research on synaptic plasticity and memory has traditionally been neuron-centric. Nevertheless, it is crucial not to ignore the role of astrocytes in these processes since these glial cells are now known to play a more active part in complex neural processing in the healthy CNS than previously recognized. Increasing evidence support the existence of a bidirectional communication between neurons and astrocytes in the control of brain function, giving rise to the concept of “tripartite synapse” which postulates that astroglial cells are the third active element of synapses. Thus, astrocytes release and uptake gliotransmitters within the synaptic cleft to fine-tune synaptic transmission. The present study aims to evaluate the impact of astrocytes on synaptic plasticity in hippocampal circuits to later understand the role of astrocytes to control memory processes in physiological and pathological conditions associated with cognitive deficits, such as in Alzheimer’s disease (AD).Different pharmacological tools were used to interfere with astrocytes to further evaluate the contribution of these star-shaped cells in synaptic plasticity events, namely long-term potentiation (LTP) in the Schaffer collateral (SC) - CA1 pyramidal neurons. Acute incubation with two distinct gliotoxins, L-α-aminoadipic acid (L-AA) and trifluoroacetic acid (TFA), led to a significant reduction (about 38%) in LTP amplitude. These results were supported by those showing that the blockade of exclusive astrocytic functions, such as glutamate uptake from the synaptic cleft (using a selective inhibitor of glutamate transporter-1 named dihydrokainic acid DHK) and hemichannels (HCs)-mediated gliotransmitter release (via inhibition of HCs and gap junction with carbenoxolone, CBX), also significantly decreased LTP. Taken together, these results showed that by manipulating astrocytic function in different ways in vitro, we were able to reproduce the same effect on mouse hippocampal LTP. Adenosine A2A receptors (A2ARs) are known to have a key role in controlling synaptic transmission, either by pre- or postsynaptic mechanisms, and tetanic stimulation is known to trigger release of adenosine triphosphate (ATP) from astrocytes and ATP-derived adenosine activates A2ARs. Thus, we took advantage of a selective A2AR antagonist (SCH58261) to probe the role of these receptors, which are also expressed in astroglial cells, in the modulation of LTP in hippocampal slices. However, due to the low number of experiments done in these group of results, what we can say is that apparent astrocytic dysfunction abrogates the role of A2ARs on proper control of synaptic plasticity.Since astrocytes alter their physiology drastically in response to injury or disease states, it is of utmost importance to create in vivo models to gather new information about the involvement of astroglia in brain pathologies, like Alzheimer’s or Parkinson’s (PD) disease, and pave the way to develop new therapeutic strategies. Bilateral intracerebroventricular (icv) injection of L-AA, a specific gliotoxin, into the two lateral ventricles of C57Bl/6 mice, we were able to work with an animal model in which astrocytic function were seriously compromised. From this point, memory performance and synaptic plasticity were accessed in these animals to evaluate astrocytic contribution. Mice were tested in novel object recognition (NOR) tasks 72 h after the injections (L-AA or vehicle); however, our results about memory performance in these two animal groups did not reach statistical significance. On the other hand, when LTP was measured in the SC-CA1 synapses of L-AA-injected mice a significant depression in LTP amplitude was observed (about 25%), when comparing with vehicle-injected mice, going in accordance with the previous results regarding acute incubation of the gliotoxin in hippocampal slices. Additionally, immunohistochemical analysis probing for astrocytic markers, such as the glial fibrillary acidic protein (GFAP) and glutamine synthetase (GS), were performed in transverse hippocampal sections obtained from slices acutely exposed to the gliotoxin or slices from L-AA-injected mice. The results revealed a decrease in the number of GFAP-positive cells in hippocampal sections from L-AA-injected animals, reinforcing that indeed this gliotoxin was interfering with astrocytes.The ability to rapidly alter the strength of synaptic connections between neurons is thought to be the molecular basis underlying learning and memory. Therefore, identifying the mechanisms that lead to changes in synaptic strength has fundamental implications for understanding proper brain function. The current work presents strong evidence for the involvement of astrocytes in modulating mouse hippocampal long-term potentiation.

O estudo dos processos de plasticidade sináptica e de memória tem sido tradicionalmente centrada nos neurónios, porém, não deve ser ignorado nestes processos o possível papel dos astrócitos, as células maioritárias no cérebro. Existem evidências que suportam a existência de uma comunicação bidirecional entre astrócitos e neurónios ao nível sináptico, denominada de “sinapse tripartida”, que reconhece os astrócitos como o terceiro elemento ativo na transmissão sináptica. Assim, os astrócitos, para além de captarem neurotransmissores, são capazes de libertar gliotransmissores para a fenda sináptica, modulando sincronicamente a transmissão sináptica. O presente estudo tem como objetivo avaliar o impacto dos astrócitos na plasticidade sináptica em circuitos do hipocampo, e consequentemente compreender a contribuição destas células no controlo de processos de formação de memórias, tanto em condições fisiológicas como patológicas associadas a défices cognitivos, como é o caso da doença de Alzheimer.Diferentes ferramentas farmacológicas foram utilizadas para interferir com os astrócitos e, consequentemente, avaliar a sua contribuição em processos de plasticidade sináptica, nomeadamente na potenciação de longa duração (LTP) registada nos neurónios piramidais presentes na região CA1 do hipocampo na via proveniente dos colaterais de Schaffer (CS). A incubação aguda de fatias de hipocampo com duas gliotoxinas diferentes, L-α-aminoadipato (L-AA) ou trifluoroacetato (TFA), levou a uma redução significativa na amplitude da LTP ( ̴ 38%). Estes resultados foram corroborados pelos efeitos observados quando se bloqueou funções específicas dos astrócitos, como é o caso da captação de glutamato da fenda sináptica, através do inibidor especifico dihidrokainato (DHK), e da libertação de gliotransmissores através de hemicanais (HCs), utilizando o bloqueador de HCs e junções gap carbenoxolone (CBX), pois os bloqueadores destas vias de transporte também diminuíram significativamente a LTP. No seu conjunto, os resultados mostraram que, independentemente da forma como manipulamos os astrócitos in vitro, obtemos uma redução consistente na LTP. Os recetores de adenosina do subtipo A2A (A2AR) são conhecidos por terem um papel fundamental no controlo da transmissão sináptica, através de mecanismos pré- ou pós-sinápticos. Foi também mostrado que após estímulos de elevada frequência, os astrócitos são capazes de induzir a libertação de ATP para a fenda sináptica, onde é metabolizado em adenosina, podendo ativar os A2AR. Para investigarmos o papel dos A2AR astrocíticos na modulação da LTP no hipocampo, um antagonista seletivo para estes recetores foi utilizado (SCH58261). Porém, como o número de condições é bastante limitado neste grupo de experiências, a conclusão que podemos retirar é que a plasticidade sináptica parece não ser alterada na presença de SCH58261 e L-AA, aparentando que os A2AR deixam de controlar a plasticidade sináptica quando os astrócitos estão disfuncionais.Uma vez que os astrócitos são capazes de alterar a sua morfologia e as suas funções em resposta a diferentes lesões, é extremamente importante que sejam criados modelos in vivo para recolher dados acerca do envolvimento da astroglia em patologias cerebrais, como é o caso da doença de Alzheimer. Assim, fizemos a administração da gliotoxina L-AA em ambos os ventrículos laterais de murganhos adultos para investigar o impacto dos astrócitos na função sináptica e na memória. Avaliámos a memória dependente do hipocampo, através do teste de reconhecimento de objetos (NOR), que foi realizado 72 horas após a injeção de L-AA ou de solução salina. Os resultados obtidos não revelaram efeitos significativos do L-AA na memória dos animais; no entanto, o estudo da LTP mostrou uma diminuição significativa na amplitude da potenciação nos murganhos injetados com a gliotoxina relativamente aos controlos ( ̴ 25%). Os resultados obtidos com a administração in vivo de L-AA na LTP foram consistentes com os observados quando se fez a incubação aguda da gliotoxina na fatia de hipocampo. Para além dos estudos funcionais de eletrofisiologia, fomos também investigar o impacto da gliotoxina (incubação aguda e injeção) em marcadores astrocíticos (proteína ácida fibrilar glial, GFAP e glutamina sintetase, GS), utilizando técnicas de imunohistoquímica. Nas secções de hipocampo de animais injetados com L-AA, observámos um decréscimo no número de células marcadas com GFAP, o que reforça as evidências de que a gliotoxina está a interferir com os astrócitos, o que provavelmente está a diminuir a LTP.A capacidade das sinapses modificarem a transmissão sináptica, mantendo um estado dinâmico e saudável no cérebro é reconhecido como sendo um processo essencial na aprendizagem e formação de memórias, sendo por isso imperativo conhecer os mecanismos que medeiam estes processos. Este trabalho apresenta evidências firmes sobre a contribuição dos astrócitos na modulação da LTP no hipocampo.