Please use this identifier to cite or link to this item: https://hdl.handle.net/10316/82997
Title: Detection of genetic biomarkers of lung cancer using enhaled breath condensate
Other Titles: Deteção de biomarcadores genéticos do cancro do pulmão através da condensação do ar exalado condensado
Authors: Mestre, Beatriz de Almeida Gonçalves Carrilho 
Orientador: Prazeres, Hugo João Marques
Pires, Paula Cristina Veríssimo
Keywords: Cancro do Pulmão; Ar exalado condensado; biomarcadores genéticos; Otimização de protocolo; mutations; Lung Cancer; Exhaled breath condensate; genetic biomarkers; Optimization of Protocol; mutações
Issue Date: 18-Sep-2017
Serial title, monograph or event: Detection of genetic biomarkers of lung cancer using enhaled breath condensate
Place of publication or event: IPN TecBis
Abstract: O cancro de pulmão é uma das principais causas oncológicas de morte em todo o mundo, constituindo o segundo tipo de cancro mais frequentemente diagnosticado. Esta patologia tem um decurso “silencioso”, não produzindo sintomas característicos que permitam a sua detecção precoce, o que faz com que normalmente seja detectada tardiamente, já numa fase inoperável. Este diagnóstico tardio contribui para uma taxa de sobrevivência a 5 anos de apenas 18.7 %. No entanto, a sobrevida é significativamente melhor quando o cancro do pulmão é detectado em estágio inicial, com a taxa de sobrevivência a 5 anos a aumentar para 50-70%,. Assim sendo, o controlo da mortalidade por cancro do pulmão dependente do desenvolvimento de métodos específicos de diagnóstico precoce que possam ser empregues no rastreio de base populacional como forma de prevenção secundária. Nas últimas quatro décadas, o diagnóstico precoce tem sido amplamente investigado como uma opção para reduzir a mortalidade do cancro do pulmão. Nos anos 70 e 80 do século XX, foram praticados vários estudos de rastreio com recurso à radiografia ao tórax e citologia da expectoração em população de risco. No entanto, estes estudos não geraram qualquer redução na taxa de mortalidade e, por isso, não são recomendados como método de rastreio. Recentemente, a National Lung Screening Trial (NLST) demostrou que a tomografia computorizada de baixa dose levou a uma redução de 20% na taxa de mortalidade numa população de alto risco. O sucesso deste levou a que este método de rastreio fosse implementado nos Estados Unidos da América. Contudo, ensaios Europeus de rastreio do cancro do pulmão ainda não relataram uma vantagem clara na implementação deste método numa população de alto risco. Deste modo, no actual estado da arte não existe nenhum teste que seja consensualmente recomendado para fazer parte de um programa de rastreio em população assintomática. Com o aumento do conhecimento da biologia do cancro do pulmão é sabido que diversas alterações genéticas estão associadas ao desenvolvimento desta doença, particularmente: mutações em oncogenes, metilação nas ilhas CpG de genes supressores de tumores, perda de heterozigotia e instabilidade de microssatélites. Estas alterações genéticas e epigenéticas não têm apresentado sensibilidade e especificidade aceitável por si só, pelo que a utilização de um painel de marcadores moleculares que atinja uma sensibilidade e especificidade credível no diagnósticos precoce do cancro do pulmão é muito promissor.Constatou-se que no cancro há uma maior libertação de DNA por parte do tecido tumoral para os fluidos corporais. No que toca ao pulmão, as vias aéreas inferiores são revestidas por um fluido protector e estudos demonstraram que é possível obter DNA do ar exalado que se pensa provir deste fluido. Além disto, foi possível detectar alterações moleculares características do cancro do pulmão neste tipo de amostras, o que perspectiva a sua aplicação como material biológico de partida para a análise de marcadores moleculares do cancro. Neste sentido, o ar exalado condensado tem aberto fronteiras no desenvolvimento de metodologias para diagnóstico precoce na área do cancro do pulmão. Com base nestes estudos, a Starup Infogene desenvolveu e patenteou um dispositivo de sopro, designado Oncospro, portátil e de auto-colheita, que permite a recuperação de biomoléculas do ar exalado condensado através da sua captura num filtro. A presente tese tem como principal objectivo optimizar o protocolo laboratorial de recuperação da amostra biológico a partir do dispositivo de sopro, de modo a obter a maior quantidade possível de material biológico para análises moleculares posteriores. A eficiência dos diversos protocolos foi avaliada com base em 2 critérios: quantidade e qualidade de DNA, pela medição da absorvância a 260, 280 e 230 nm por espectrofotometria e por um método fluorométrico e; a integridade e qualidade do DNA obtido para amplificação, através de PCR e electroforese em gel de agarose. Através da modificação de diversos parâmetros no protocolo, obteve-se uma maior quantidade de DNA, cumprindo-se o objectivo estipulado. O cumprimento deste levou à posterior realização de um estudo populacional num grupo de controlos, constituído por pessoas saudáveis, fumadoras e ex-fumadoras, com idade superior a 50 anos. Neste estudo foi possível obter e amplificar o DNA proveniente do ar exalado em todas as amostras da população, revelando a eficácia do método de extração otimizado. Uma vez alcançada esta meta com sucesso, uma etapa futura passará pela identificação de um painel de marcadores moleculares genéticos sensíveis e específicos para a detecção precoce e previsão de resposta terapêutica do cancro do pulmão pelo ar exalado, através de um estudo clínico.
Lung cancer, the second most diagnosed type of cancer, is one of the primary oncological causes of death in the world. This pathology has a silent course, with characteristic symptoms that would allow its precocious detection being absent. This leads to a late detection that often occurs in a non-operable phase of the cancer, contributing to a 5 year survival rate of only 18,7 %. In the rare cases that the cancer is detected in an initial state, the survival rate augments significantly to 50-70 %. Therefore, controlling lung cancer-derived mortality relays on the development of specific methods for precocious diagnosis that are employable to the population basis as a secondary prevention measure. In the last four decades early diagnosis methods have been widely investigated as an option to reduce lung cancer mortality. In the 70’s and the 80’s several studies of screening were conducted with the use of thorax radiography and expectoration cytology methods in risk populations. However, these studies failed to show a reduction in mortality rate and, therefore, are not recommended as screening methods. Recently, National Lung Screening Trial (NLST) demonstrated that computerized tomography in low doses lead to a 20% reduction in the mortality rate in one risk population. The success of this method lead to its implementation in the USA. Nevertheless, European screening tests have yet to proof a clear advantage in the implementation of the latter method in high risk populations. Therefore, in the current state of the art there is no trial consensually recommended to be a part of a screening program in asymptomatic populations. With the rise in cancer biology knowledge it is now known that several genetic alterations are associated with the development of this disease, particularly: mutations in oncogenes, methilation in CpG islands of tumor suppressor genes, loss of heterozygoty and microsatellite instability. These genetic and epigenetic alterations have not shown enough sensibility and specificity alone but a panel of molecular markers that reaches a desirable sensitivity and specificity for precocious diagnosis is very promising. It was found that in cancer there is a higher release of DNA by tumor tissue into body fluids. In what concerns the lungs, the inferior airways are covered by a protector fluid and studies have demonstrated that it is possible to obtain DNA from exhaled air that it is thought to come from this fluid. Also, it was possible to detect molecular alterations characteristic of lung cancer in these types of samples, what puts into perspective its application as biological material for analysis of cancer molecular markers. In this sense, condensed exhaled air has opened frontiers in the development of methodologies for precocious diagnosis in the lung cancer field. Based on these studies, the startup Infogene developed and patented a portable and self-harvest blowing device denominated Oncosopro, which allows the recovery of biomolecules from condensed exhaled air through a small filter. The current thesis has as a main goal the optimization of the laboratory protocol for sample recovery by the patented blowing device, in order to obtain the major possible quantity of biological material for posterior molecular analysis. The efficiency of several protocols was evaluated based on two criteria: quantity and quality of the DNA, measured through espectrophotometry and another fluorometric method; and the integrity and quality of the DNA obtained for further amplification through PCR and electrophoresis. Through the modification of several parameters in the protocol, a higher quantity of DNA was obtained, meeting the stated goal. A posterior population trial in control groups formed by healthy people, smokers and ex-smokers over 50 years old showed this optimized extraction method is effective for recovery and amplification of the exhaled air DNA.A future phase will rely on the identification of a panel of genetic molecular markers sensible and specific for early detection of lung cancer as well as a method of prediction of the respective therapeutic answer using exhaled air. Clinical utility can be validated through determination of several parameters, such as specificity, sensibility, positive predictive value and negative predictive value of this DNA recovering method. Upon the clinical validation, this method might be employed into screening programs in order to reduce the mortality rate in this oncological disease.
Description: Dissertação de Mestrado em Bioquímica apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia
URI: https://hdl.handle.net/10316/82997
Rights: embargoedAccess
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