Identificação de inibidores de glicólise com efeito potenciador de terapia fotodinâmica in vitro

Abstract

The selectivity of treatments used in cancer therapies is essential to enable drugs to kill cancer cells while sparing normal cells. Most approaches to improve selectivity aim at targeting the tumor through chemical modifications of the drug. This leads to new drugs and lengthy regulatory pathways for marketing authorization. Alternatively, the combination of different drugs may potentiate the efficacy and selectivity of a treatment leading to the administration of lower doses, thereby minimizing adverse effects, and facilitate clinical approval. This work presents the combination of photodynamic therapy (PDT) with glycolysis inhibitors to improve efficacy and selectivity in cancer treatments.PDT uses a photosensitizer and light with an appropriate excitation wavelength that activates the photosensitizer in the presence of oxygen to produce reactive oxygen species and, consequently, cell damage. Tumor cells have an alteration in glucose metabolism, characterized by an increase in glycolysis pathway, even in environments with normal oxygen concentration (Warburg Effect). This modification has been explored, including in clinical trials, with the expectation that the inhibition of glycolysis should alter especially the metabolism of tumor cells. 2-Deoxyglucose (2DG) is a compound that is phosphorylated to 2-deoxyglucose-6-phosphate, which is not metabolized and accumulates in the cell, inhibiting glycolysis. 3-Bromopyruvate (3BP) inhibits hexokinase (an enzyme of the glycolytic pathway) and also has effects on mitochondria, inducing cell death. Oxythiamine (OXY) is an analogue of thiamine and a noncompetitive inhibitor of transketolase (an enzyme of pentose phosphate pathway). Transketolase plays a vital role in the synthesis of important molecules for cell survival, directly correlated to glycolytic pathway. The inhibition of this enzyme leads to apoptosis of cancer cells. The hypothesis investigated in this study is that the inhibition of glycolysis, through these molecules, increases oxidative stress in the cell which may increase the sensitivity to the oxidative stress produced by PDT.In vitro combination studies were performed in both cancer and normal cell lines, CT26 (colon carcinoma – mouse) and NIH/3T3 (fibroblasts – mouse), respectively. We started our studies with the evaluation of IC50 of redaporfin in the different cell lines and then co-incubation with 2DG, 3BP and OXY at nontoxic concentrations, in order to examine which combination was more effective than the individual effects. Combination of PDT-redaporfin with 2DG and OXY did not improve neither the efficacy nor the selectivity of the treatment. The most promising result is the combination of a 10 µM dose of 3BP with PDT-redaporfin. This combination increases the efficacy of the treatment and is more selective to the cancer cell line.

A seletividade nos tratamentos utilizados em cancro é essencial para que haja uma maior capacidade de matar as células cancerígenas sem alterar as células normais. A maioria das abordagens para aumentar a seletividade passam por direcionar a terapia para o tumor fazendo alterações no fármaco, mas isto leva a novos fármacos e à necessidade de passarem por uma nova fase de aprovação e autorização de venda. Uma alternativa é a utilização de combinações de fármacos, podendo potenciar a sua eficácia e seletividade, administrando-se doses mais baixas e minimizando os efeitos secundários, facilitando a aprovação clínica da sua utilização. Neste trabalho apresenta-se a combinação de terapia fotodinâmica com inibidores da glicólise, com o objetivo de aumentar a eficácia e seletividade da terapia do cancro. A Terapia Fotodinâmica (PDT) utiliza um fotossensibilizador, que é um fármaco que por si só não é prejudicial para a saúde, e luz, que no comprimento de onda adequado, ativa o fotossensibilizador, de modo a produzir espécies reativas de oxigénio e, consequentemente, danos nas células. As células tumorais apresentam uma alteração do metabolismo da glicose, caracterizada por um aumento da glicólise, mesmo em ambientes com concentrações normais de oxigénio (efeito de Warburg), sendo esta uma característica útil para o design de novas estratégias terapêuticas para eliminar, preferencialmente, as células tumorais por inibição da glicólise. Esta modificação tem sido estudada a nível clínico, com a expectativa de que, inibindo a glicólise, se afete, mais significativamente, o metabolismo das células tumorais. A 2-deoxiglucose (2DG) é um composto que, uma vez no interior da célula, é fosforilado a 2-deoxiglucose-6-fosfato, que não é metabolizado, acumulando-se no meio intracelular, inibindo a glicólise. O 3-bromopiruvato (3BP) inibe a hexocinase, uma enzima da via glicolítica, e provoca efeitos na mitocôndria, induzindo morte celular. A oxitiamina (OXY) é um análogo da tiamina e um inibidor não competitivo da transquetolase (uma enzima da via da pentose fosfato). A transquetolase é essencial para a síntese de moléculas importantes para a sobrevivência celular, relacionando-se diretamente com a via glicolítica. A inibição desta via, leva a apoptose das células tumorais. A hipótese avaliada neste estudo é que a inibição da glicólise, através destas moléculas, aumente o stress oxidativo nas células, podendo aumentar a sensibilidade das células para o stress oxidativo produzido durante a PDT. Os estudos in vitro foram realizados numa linha celular tumoral e numa linha celular normal, as CT26 (carcinoma do colon de murganho) e NIH/3T3 (fibroblastos de murganho), respetivamente. Os estudos começaram com a avaliação do IC50 da redaporfin nas duas linhas celulares seguida da aplicação de doses não tóxicas de 2DG, 3BP e OXY, para avaliar se a combinação é mais eficaz do que os efeitos individuais. A combinação entre PDT-redaporfin e 2DG ou OXY não mostrou melhorias muito significativas, nem a nível da eficácia, nem a nível da seletividade. Porém, a combinação de uma dose de 10 µM de 3BP com PDT-redaporfin aumentou a eficácia da terapia e mostrou uma maior seletividade para a linha celular tumoral em comparação com a não tumoral.