Assaying synaptic function using genetically -encoded optical reporters in the context of Alzheimer's disease.

Abstract

A doença do Alzheimer é uma doença que afecta maioritariamente a população sénior1. Estudos recentes comprovam que não é a patologia das proteínas amilóide β e Tau per se mas sim a disfuncção e/ou perda de sinapses, e consequente perda de conectividade entre regiões do cérebro, que originam os sintomas realcionados com a memória e os processos cognitivos na doença do Alzheimer2. Sendo que a disfunção sináptica é um processo reversivel que pode ser detectado em fases inciais da doença do Alzheimer, é importante desenvolver ferramentas necessárias para o estudo da função sináptica no contexto desta doença.Para tal, neste projecto foram usadas indicadores de cálcio geneticamente codificados denominados reporteres. Mudanças na concentração de cálcio na região présináptica foram estudadas usando repórteres como SyGCaMP6f, SyjRCaMP1b e SyjRGECO1a e na região pós-sináptica, usando reporters como Actina-GCaMP6f. A excitabilidade neuronal foi estudada através da caraterização de um reporter recentemente publicado que é direcionado para o soma denominado H2B-GCaMP6f. A excitabilidade neuronal advém de uma combinação de propriedades intrinsicas da membrana celular (onde se inclui o potencial de membrana em repouso e a resistência da membrana) com a plasticidade sináptica3,4. Fluoforos orgânicos como Fluo-4 ou Cal-520 podem ser usados para medir a excitabilidade neuronal, contudo esses fluoforos não exibem um sinal suficientemente sensivel a mudanças de voltagem na membrana porque são expressos e difusos ao longo do neurónio5. Desta forma, desenvolveu-se um construct - AAV6:hSynapsin1:H2B-GCaMP6f – em que o reporter mais sensivel desenvolvido até hoje – GCaMP6f – é ligado por engenharia genética a uma sequência da histona H2B7, 8. H2B-GCaMP6f foi caracterizado como um reporter somático sensível ao cálcio assim como a sua utilidade em testes preliminares de farmacologia, tendo sido usado três moduladores de excitabilidade neuronal: um inibidor de canais de sódio depedentes da voltagem (KV1.3 blocker) 9, um modulador positivo dos receptors AMPA (AMPA PAM ) - LY45010810 – e um composto confidencial vindo de uma análise fenotipica da J&J,denominado Composto X. Testes farmacológicos foram realizados em culturas neuronais primárias de hipocampo de rato em duas condições experimentais diferentes: na presença de 0.01 mM NBQX (antagonista dos receptors AMPA) e 0.05 mM D-AP5 (antagonista dos receptores NMDA) e na ausência deste inibidorees sinápticos. Para além da caracterização de H2B-GCaMP6f, a dinâmica de todos os reporters pre-sinápticos mencionados acima foi tambem caracterizada através de estimulação eléctrica de sequências com diferentes numeros de potenciais de ações a 20Hz. Gravações em tempo real foram também efectuadas usando SyjRGECO1a e H2B-GCaMP6f para comparar respostas sinápticas e somáticas simultaneamente.Combinando um reporter somático integralmente caracterizado, como o H2B-GCaMP6f, com diferentes reporters sinápticos emitindo fluorescência com o comprimento de onda na zona verde e vermelha do espectro, é possível desenvolver ferramentas para uma melhor compreensão da excitabilidade neuronal e funcção sináptica , que futuramente poderá ser usada para análises fenotipicas ou dirigidas de compostos no contexto da doença do Alzheimer ou outras doenças neurológicas.

Alzheimer’s disease (AD) is a devastating disease affecting mostly the elderly population1. Current studies show that importantly, not amyloid or Tau pathology per se, but synapse dysfunction/loss and the consequent loss of connectivity between brain regions correlates well and underlie the cognitive and memory symptoms of AD2. Since synaptic loss is a reversible process and can be detectable in the early phases of the disease progression, it is important to develop the tools necessary for assaying synaptic function in the context of AD pathology.In this projected, we used genetically-encoded calcium indicators (GECIs) to assay synaptic function. Changes in pre-and post-synaptic Ca2+ were monitored using SyGCaMP6f, SyjRCaMP1b, SyjRGECO1a as pre-synaptic calcium reporters and actin-GCaMP6f as post-synaptic calcium reporter. Neuronal excitability was evaluated by characterizing a recently published somatic calcium reporter - H2B-GCaMP6f. Neuronal excitability can be considered as a combination of intrinsic membrane properties - including membrane resting potential and input resistance - with synaptic plasticity events3,4. Organic dyes such as Fluo-4 or Cal-520 can be used to measure neuronal excitability, however fluorophores do not show a sensitive voltage-dependent signal with a single cell resolution due to its expression along the entire neuron5. To overcome this drawback we developed a new construct - AAV6:hSynapsin1:H2B-GCaMP6f -in which the fastest green genetically-encoded calcium reporter -GCaMP6f6 - was fused to a H2B sequence7, 8. H2B-GCaMP6f was characterized as a somatic calcium reporter as well as characterized its utility of this reporter in preliminary pharmacology assays by testing three different compounds that modulate neuronal excitability – a KV1.3 channel blocker9, LY45010810 (AMPA PAM) and a confidential compound from a phenotypic screening effort within J&J, called Compound X. Pharmacological tests were performed in primary neuronal cultures of rat hippocampus in two conditions - presence of 0.01 mM NBQX (AMPA antagonist) and 0.05 mM D-AP5 (NMDA antagonist), and absence of these synaptic blockers. Beside H2B-GCaMP6f characterization, the dynamic range of all the pre-synaptic reporters mentioned above was characterized by delivering trains of different number of APs at 20Hz. Multiplex imaging using SyjRGECO1a and H2B-GCaMP6f was also performed to analyze somatic and synaptic response simultaneously. Combining a full characterized somatic reporter -H2B-GCaMP6f- with green and red shifted variants of sensitive calcium reporters, we are developing tools to a better understanding of neuronal excitability and synaptic function that can be further used during phenotypic or target-based drug screening efforts in the context of Alzheimer’s disease or other neurological diseases.