2B or not 2B that is the question about the synaptic proteasome in glutamatergic synapses

Abstract

Os receptores NMDA são canais iónicos transmembranares permeáveis ao cálcio, os quais têm um papel fundamental na transmissão sináptica excitatória. Estes receptores são compostos por quatro subunidades, sendo que duas das quais são subunidades GluN1 e outras duas são subunidades GluN2. No hipocampo, as subunidades GluN2A e GluN2B são as duas formas dentro da família da subunidade GluN2 que integram os receptores NMDA. As subunidades GluN2A e GluN2B conferem propriedades diferentes ao receptor NMDA e podem até interagir com diferentes moléculas, o que afecta a localização subcelular dos receptores NMDA. Os receptores NMDA, através da sua associação com a PSD-95, fazem parte dum complexo macromolecular organizador, denominado densidade pós-sináptica, que aproxima os intervenientes de cascatas de sinalização, como a CaMKII, do cálcio que entra pelos receptores NMDA. A memória, a aprendizagem e o desenvolvimento do cérebro envolvem uma restruturação ao nível das função e eficácia sinápticas. O proteassoma tem uma função nessa restruturação através do controlo espacial e temporal do conteúdo proteico da densidade pós-sináptica. A CaMKII liga-se à subunidade GluN2B e também medeia o recrutamento do proteassoma para as espículas dendríticas. Além do seu papel estrutural, a CaMKII fosforila a subunidade Rpt6 do proteassoma influenciando deste modo a actividade do proteassoma. Contudo, a relação entre a subunidade GluN2B e o proteasoma foi até agora pouco estudada. No decurso desta tese, testámos se os receptores NMDA contendo a subunidade GluN2B influenciam a quantidade de proteassoma sináptico, baseados num estudo anterior do nosso laboratório em que foi observado, por análise proteómica quantitativa, que algumas subunidades do proteassoma, especificamente as subunidades α1, 3 e 6 e β1 e 2, estavam diminuídas nas densidades pós-sinápticas de neurónios corticais quando a subunidade GluN2B está ausente. Embora não tenhamos detectado alterações nos níveis de proteassoma entre neurónios GluN2B(-/-) e GluN2B(+/-), quer em extractos membranares quer em sinaptoneurosomas, avaliámos a actividade do proteassoma em ambos os genótipos quer medindo in vitro a actividade da subunidade β5 do proteassoma 20S quer analisando em neurónios vivos os níveis do repórter de degradação UbG76V-GFP. Deste modo, verificámos que a actividade do proteassoma está diminuída em extractos totais obtidos de neurónios que não contêm a subunidade GluN2B, quando comparados com neurónios GluN2B(+/+). Com o propósito de perceber se a subunidade GluN2B regula a mobilidade sináptica do proteassoma, fizemos alguns progressos na implementação de um ensaio de FRAP para a avaliação da mobilidade sináptica da subunidade Rpt1-EGFP, para que utilização num futuro próximo. Por fim, verificámos que a co-colocalização de ambas as subunidades GluN1 e Rpt3 aumenta ao longo do desenvolvimento de neurónios do hipocampo, e que a localização sináptica de ambas apresenta aumentos nos mesmos momentos temporais do desenvolvimento neuronal. Logo, estas observações podem indicar que a localização destas proteínas é inter-dependente.Em suma, estas descobertas constituem um ponto de partida para estudar de um ponto de vista mecanístico como a subunidade GluN2B e o proteassoma estão associados.

NMDA receptors (NMDAR) are calcium-permeable transmembrane ion channels, which are key players in excitatory synaptic transmission. As tetrameric receptors, they are typically composed of two GluN1 subunits and two GluN2 subunits. In the hippocampus, GluN2BA and GluN2B are the two predominant forms of the GluN2 subunit family that are part of NMDA receptor composition. Both GluN2B subunits confer distinct properties to the NMDA receptors and could have distinct interacting partners which affect their subcellular localization. Through association with PSD-95, NMDA receptors are part of an organizing macromolecular complex, the postsynaptic density (PSD), which brings together downstream signaling transducers, like CaMKII, to NMDAR-mediated calcium influx. Memory, learning and brain development involve restructure at the level of synaptic function and strength. The proteasome has a role in these rearrangements by controlling temporally and spatially the PSD content. CaMKII binds to the GluN2B subunit and also mediates the recruitment of the proteasome into dendritic spines. Besides this structural role, CaMKII phosphorylates the proteasome subunit Rpt6 through which it influences the proteasome activity. Nevertheless, the connection between the GluN2B subunit and the proteasome is not well characterized.In this thesis, we started by studying how NMDA receptors containing the GluN2B subunit influence the neuronal proteasome content, based on the fact that it was previously observed in our laboratory by quantitative proteome analysis that proteasome subunits, in particular α1, 3 and 6 and β1 and 2 subunits of the 20S proteasome, were decreased in PSDs of cortical neurons in the absence of GluN2B. Although we could not detect changes in the proteasome content in membrane fractions or synaptoneurosomes of GluN2B(-/-) neurons when compared to wild-type neurons, we measured the proteasome activity in GluN2B(-/-) and wild-type neurons, both in vitro by evaluating the 20S β5 activity and in live neurons by analysis of the UbG76V-GFP degradation reporter levels. We found that the proteasome activity was decreased in whole extracts obtained from neurons lacking the GluN2B subunit, compared to wild-type neurons. To understand whether the GluN2B subunit regulates the synaptic mobility of the proteasome, we made progress in implementing a FRAP assay to evaluate the synaptic mobility of the proteasome subunit Rpt1-EGFP, to allow us to study this aspect in the future. Finally, we found that the colocalization of the NMDAR GluN1 subunit and the Rpt3 proteasome subunit increased along development of cultured hippocampal neurons, and that their synaptic localization showed a similar developmental pattern. These observations could indicate that localization of these proteins is interdependent.Overall, these findings constitute a starting point for exploring further from a mechanistic point of view how the GluN2B subunit and the proteasome are connected.