The role of miRNAs on cell survival

Abstract

As doenças cardiovasculares são a causa predominante de mortalidade, morbidade e custos associados com a saúde na Europa e nos Estados Unidos da América. Estão incluídas nas doenças cardiovasculares, patologias como enfarte do miocárdio, cardiomiopatias ou doenças cardíacas valvulares, que poderão culminar em insuficiência cardíaca. Doentes com esta condição apresentam um desempenho cardíaco reduzido sendo incapazes de suprimir as necessidades metabólicas do organismo. Para além do mais, o aumento da esperança média de vida, o estilo de vida sedentário e maus hábitos alimentares, assim como a maior taxa de sobrevivência após diagnóstico de uma doença cardíaca reforçam a necessidade do desenvolvimento de tratamentos eficazes para curar a insuficiência cardíaca. Nos últimos anos, o grande foco da pesquisa nesta área tem passado pelo desenvolvimento de estratégias que estimulem a proliferação dos cardiomiócitos. Contudo, os resultados obtidos têm ficado aquém das expectativas realçando a necessidade de uma mudança de direção. Recentemente, alguns autores demonstraram o papel importante do endotélio na regeneração cardíaca. Paralelamente, os “miRNAs” surgiram como moduladores versáteis dos processos intracelulares inclusive no contexto de doença cardíaca.O nosso grupo realizou uma experiência em larga escala para identificar “miRNAs” capazes de aumentar a sobrevivência celular endotelial. Brevemente, células endoteliais humanas foram transfectadas com 2080 “miRNA mimics” e expostas a condições de isquémia (0,1% O2 em meio basal sem soro ou fatores de crescimento). Quinze “miRNAs” foram identificados como capazes de aumentar a sobrevivência. Nesta tese, estudámos o papel de dois desses “miRNAs” (um previamente descrito na literatura como capaz de aumentar a sobrevivência e um nunca descrito). Na primeira parte do trabalho, desvendámos o mecanismo de acção o qual confere um efeito na sobrevivência celular. Na segunda parte, explorámos uma nanoformulação capaz de entregar os “miRNAs”.Os nossos resultados demonstram que ambos os “miRNAs” aumentaram a sobrevivência e a capacidade de migração das células endoteliais. Em seguida, validámos a interação directa dos dois “miRNAs” com a proteína PTEN levando a uma diminuição nos seus níveis de RNA mensageiro e proteicos. Ambos os “miRNAs” levaram à ativação de duas vias intracelulares relacionados com a sobrevivência: vias “Pi3K/Akt” e “MAPK”. Por fim, usámos nanopartículas poliméricas sensíveis à luz para entregar os “miRNAs” a células endoteliais e os nossos resultados preliminares apontaram para uma alta taxa de complexação e um forte potencial de entrega.O nosso trabalho apresenta estes “miRNAs” como fortes promotores da sobrevivência endotelial após condições isquémicas.

Cardiovascular diseases are the leading cause of mortality, morbidity and health related costs in Europe and United States of America. They comprise different pathologies including myocardial infarction, cardiomyopathies and valvular heart disease all of them ultimately leading to heart failure (HF). HF is broadly characterized by and inability to efficiently fulfill the metabolic needs of the organism. The increase in life expectancy, the high prevalence of dietary and lifestyle risks factors, as well as the improved survival from cardiovascular events reinforces the need for efficient treatments to revert HF. During the last years, most of the research performed in that respect pertained to the discovery of molecules capable of enhancing cardiomyocyte proliferation. However, the results obtained with these approaches are far from ideal and a paradigm shift is necessary. Recently, several authors have demonstrated an important role of cardiac endothelium on cardiac regeneration. Moreover, miRNAs have appeared as versatile modulators of virtually all cell processes including in the cardiac context. Our group recently performed a high throughput screening experiment to identify miRNAs capable of enhancing endothelial cell survival. In brief, we transfected endothelial cells with a library of 2080 miRNA mimics and exposed the transfected cells to ischemia (0.1% O2 in endothelial basal medium without serum or growth factors). Fifteen miRNAs were identified as pro-survival miRNAs. In this thesis, we focused on the role of two of those miRNAs (a previously identified pro-survival miRNA and a miRNA never described in the literature). In the first part of the work we identified the mechanism of action governing the pro-survival effect of the selected miRNAs. In the second part, we explored a nanoparticle system capable of efficiently delivering the miRNAs to the cells both in vitro as well as in vivo. Our results showed that both miRNAs increased endothelial cell survival under ischemic conditions and increased the migration of human CD34+-derived endothelial cells. Then, we validated the direct interaction of both miRNAs with PTEN resulting in a decrease in its mRNA and protein levels. Furthermore, MAPK and PI3K/Akt pathways are activated by miR-C and miR-G both of which are well known mediators of the survival pathways. Finally, we used light-inducible polymeric nanoparticles to deliver miRNA to human derived endothelial cells with preliminary results showing their high complexation rate and strong delivery potential. Our work presents miR-C and miR-G as strong endothelial cell survival enhancers.