Role of actin regulatory proteins in Tunneling Nanotube formation and intercellular transfer in HeLa cells.

Abstract

Os túneis de nanotubos (TNTs) são canais compostos por elementos do citoesqueleto de actina que ligam o citoplasma de células distantes e que surgiram como um novo mecanismo de comunicação intercelular de longa distância. Estas estruturas dinâmicas promovem a transferência de componentes celulares como moléculas citoplasmáticas, proteínas, vesículas e organelos. Os TNTs podem ser “sequestrados” por diferentes agentes patogénicos para se propagarem entre células, estando este mecanismo implicado na progressão do cancro e doenças neurodegenerativas, representando assim um potencial alvo terapêutico.Os TNTs são formados a partir de células que estiveram previamente em contacto, ou de extensões semelhantes a filopodia, formando-se em direção a células vizinhas. A polimerização de actina tem um papel importante neste último tipo de formação dos TNTs, demonstrado ser predominante em células CAD, uma linha celular neuronal. Perceber os mecanismos de formação dos TNTs e a sua relação com a filopodia é importante para descobrir as funções fisiológicas de ambas estas estruturas, principalmente sabendo que a filopodia, contrariamente aos TNTs, não permite a transferência de diferentes componentes celulares entre células distantes.O principal objetivo desta tese é investigar o papel das proteínas ARPC2, mDia1 e Nap1 na formação de TNTs. Estas proteínas fazem parte de três conjuntos de proteínas que regulam a polimerização dos filamentos de actina - o complexo Arp2/3, as forminas e o complexo WAVE, respetivamente. Foi usada uma abordagem farmacológica e genética combinada com técnicas de biologia molecular e celular para perceber as funções das proteínas ARPC2, mDia1 e Nap1. A formação de TNTs, a dinâmica do citoesqueleto de actina e o papel dos TNTs na transferência de vesículas marcadas entre células em co-cultura foram avaliados recorrendo à microscopia confocal.Neste trabalho, mostramos que a transferência de vesículas marcadas entre células HeLa foi maioritariamente devido ao contacto entre células e esta transferência encontra-se aumentada nas células knockdown para a proteína ARPC2.Em suma, os nossos resultados fornecem novos dados sobre a remodelação do citoesqueleto de actina, bem como a sua arquitetura, envolvidos na formação de TNTs nas células HeLa.

Tunneling Nanotubes (TNTs) are F-actin containing channels that connect the cytoplasm of remote cells and recently emerged as a new mechanism for long-range intercellular communication in many cell types. These dynamic structures mediate the transfer of a wide variety of cellular materials such as cytoplasmic molecules, plasma membrane components, proteins, vesicle and organelles. In addition, TNTs can be “hijacked” by various pathogens to propagate across cells and are also implicated in cancer and neurodegenerative diseases, thus representing promising therapeutic targets.TNTs are formed either after cells previously in contact detach from each other, or from the extension of filopodia-like protrusions toward neighboring cells. Actin polymerization plays an important role in this later type of TNT formation which was demonstrated to be the predominant formation type in CAD cells, a neuronal cell line. Understanding the mechanisms of TNT formation and the relation with filopodia is of utmost importance to uncover their physiological functions, particularly since filopodia, unlike TNTs are not able to mediate the transfer of different cargoes between remote cells.The aim of this project is to investigate the role in TNT formation and function of three actin binding proteins - ARPC2, mDia1 and Nap1 – that are part of three major actin regulatory protein complexes such as Arp2/3 complex, formins and WAVE complex, respectively. A combination of pharmacological and genetics approaches combined with molecular and cellular biology techniques were used to target the roles of ARPC2, mDia1 and Nap1 proteins, and TNT formation and actin dynamics were monitored by confocal microscopy. In parallel, the role of TNTs in the transfer of labeled vesicles between cells in co-culture was also assessed by confocal microscopy.In this work, we demonstrated that the labeled vesicle transfer between HeLa cells in co-culture was mainly due to cell-to-cell contact and was increased in ARPC2 knockdown (KD) cells. Taken together, our data provides new insight regarding actin cytoskeleton remodeling and architecture underlying TNT formation in HeLa cells.