Advancing personalized medicine in methotrexate-treated diseases: hplc-dad method development for therapeutic drug monitoring

Abstract

O Metotrexato (MTX) é um fármaco antifolato usado em várias doenças, sendo que é utlizado em baixas doses, por exemplo, na artrite reumatoide e na psoríase, ou em altas doses em diversas neoplasias, de que é exemplo a leucemia aguda linfoblástica. Uma vez que o MTX tem uma janela terapêutica estreita, facilmente se atinge a dose máxima efetiva e surge toxicidade. Além disso, a variabilidade inter- e intra-doente pode contribuir para esta situação, reforçando a importância da monitorização terapêutica de fármacos para o desenvolvimento de medicina personalizada.Na literatura estão descritos diferentes métodos cromatográficos para a monitorização terapêutica do MTX, recorrendo a diferentes amostras biológicas, com o objetivo de otimizar o perfil clínico de resposta dos doentes sob terapêutica com MTX. O trabalho aqui apresentado tem por objetivo desenvolver um método analítico para a deteção e quantificação do MTX e dos seus derivados poliglutamados em eritrócitos. Para tal, recorreu-se à Cromatografia de Alta Eficiência com detetor “Diode Array” (HPLC-DAD), que permitiu a separação de MTX e os seus poliglutamatos em eritrócitos. As condições cromatográficas foram otimizadas para a separação daqueles compostos recorrendo a uma coluna XTERRA MS C18, tamanho de partícula de 5µm, 250 x 4.6mm num gradiente inicial com 94% da fase móvel A, evoluindo até 80%, durante 22 minutos, seguindo-se posteriormente num modo isocrático de 94% da fase móvel A até aos 30 min. O fluxo foi de 0,7mL/min e a separação dos compostos foi conseguida nos primeiros 17 minutos, apresentando boa resolução e boa seletividade. A preparação das amostras consistiu numa técnica de precipitação proteica, usando etanol e acetonitrilo em condições de baixa temperatura. O método validado demonstrou seletividade, linearidade e exatidão na análise de MTX, bem como demonstrou-se preciso intra- e inter-dia para a análise de MTX e MTXPG2. Os limites de quantificação para cada composto, foram respetivamente, 1,9µg/mL para MTX e MTXPG2-3, 7,5µg/mL para MTXPG4-5 e 15µg/mL para MTXPG6.A aplicação do método validado poderá vir a ser útil na monitorização terapêutica de doentes sob terapêutica com MTX, tornando-se mais relevante nas doenças em que o MTX é usado em baixa dose, em virtude da maior importância que os derivados poliglutamados assumem nesta situação para inferir sobre a farmacodinâmica do MTX. Não obstante, a observada baixa sensibilidade do método sugere que, para baixas doses de MTX deve ser necessário transpor o método para espetrometria de massa. Pelo exposto, a otimização de um método não invasivo, como o apresentado, para predição dos níveis terapêuticos de MTX quando este é usado em baixa dose, poderá contribuir para otimizar os regimes posológicos dos doentes sob terapêutica com MTX em baixa dose e, desse modo, ser útil no avanço da medicina personalizada.

Methotrexate (MTX) is an antifolate drug used in several diseases, being used in low-doses (LDMTX), for example, rheumatoid arthritis (RA) and psoriasis, or high-doses (HDMTX), in various neoplasms types as acute lymphoblastic leukaemia (ALL)). Since MTX has a narrow therapeutic range, easily maximum dose is reached and toxicity arises. Moreover, inter- and intra-patient variability can contribute for this event, reinforcing the importance of therapeutic drug monitoring (TDM) for personalized medicine (PM) development.Literature have been described different chromatographic analytical methods to MTX-TDM, with different biological samples, aiming to optimize methotrexate-treated patients’ clinical response profile. The aim of the present work was to develop an analytical method for detection and quantification of MTX and MTX polyglutamates (MTXPGs), in red blood cells (RBCs) For this, we used High-Performance Chromatography with a Diode Array detector (HPLC-DAD), which allowed the separation of MTX and its polyglutamates into erythrocytes. Chromatographic conditions were optimized for the separation of those compounds using a XTERRA MS C18 column, particle size of 5μm, 250 x 4.6mm in an initial gradient with 94% of the mobile phase A, evolving to 80% for 22 minutes, And then in an isocratic mode of 94% mobile phase A to 30 min. The flow rate was 0,7mL/min and the separation of all compounds has been obtained in the first 17min, presenting good resolution and selectivity.Sample preparation consisted in protein precipitation technique, using ethanol and acetonitrile at cold temperature conditions.The validated method demonstrated selectivity, linearity and accuracy for MTX analysis as well as precision inter and intra-day for MTX and MTXPG2 analysis. The limits of quantification for each compound were, respectively, 1.9µg/mL for MTX and MTXPG2-3, 7.5µg/mL for MTXPG4-5, and 15µg/mL for MTXPG6.The application of the validated method may be useful in the therapeutic monitoring of patients undergoing MTX therapy, becoming more relevant in diseases where MTX is used in a low dose because of the greater importance that the polyglutamic derivatives assume in this situation to infer the pharmacodynamics of MTX.Nevertheless, the observed low sensitivity of the method suggests that, for low doses of MTX (LDMTX), it should be necessary to transpose the method for mass spectrometry. Therefore, the optimization of a non-invasive method, such as that presented for the prediction of MTX therapeutic levels when used at low doses, may contribute to optimize doses regimens of patients under LDMT therapy and thus, being useful in the advancement of personalized medicine.