ATP and glutamate release by astrocytes under Alzheimer's disease conditions: modulation by adenosine A2A receptors

Abstract

A doença de Alzheimer (DA) é a maior causa de demência nos idosos. Os primeiros sinais desta doença envolvem a perda de memória, que se pensa ser desencadeada pela acumulação cortical de peptídeos β-amiloide (Aβ) e, consequente, disfunção e perda sináptica. Atualmente, considera-se que os astrócitos, as células mais abundantes no cérebro, são o terceiro elemento da sinapse, tendo um papel fundamental no controlo da excitabilidade neuronal, especialmente na modulação da plasticidade sináptica, que constitui a base neurofisiológica da memória. Contudo, embora a reatividade dos astrócitos tenha sido descrita nas fases iniciais da DA, ainda permanece por esclarecer se a modificação da função dos astrócitos afeta os eventos iniciais e a progressão de DA. Os astrócitos modulam a função sináptica pela captação de neurotransmissores, como o glutamato e o GABA, da fenda sináptica e também pela libertação de gliotransmissores, principalmente glutamato e ATP. Deste modo, alterações na gliotransmissão podem contribuir para a disfunção sináptica e subsequente neurodegeneração. No entanto, ainda permanece por estabelecer a forma pela qual a libertação de ATP e glutamato pelos astrócitos é afetada em condições de DA e os mecanismos subjacentes a esta libertação. Além disso, estudos prévios do nosso grupo mostram que os astrócitos contêm recetores de adenosina A2A (A2AR), os quais têm sido implicados na patogénese da DA, uma vez que o bloqueio destes recetores para além de prevenir a sinaptotoxicidade, também previne a reatividade e disfunção dos astrócitos desencadeada por peptídeos Aβ. No presente estudo, investigamos: i) como condições de DA afetam a libertação de ATP e glutamato, ii) os possíveis mecanismos envolvidos na libertação destes gliotransmissores, e iii) o papel dos A2AR no controlo da libertação de ATP e glutamato. Para atingir estes objetivos, usámos culturas primárias de astrócitos obtidas a partir do córtex de cérebros de ratos Wistar expostas agudamente (1 hora) ou cronicamente (24 horas) a peptídeos Aβ1-42 (1µM). Os níveis de ATP e glutamato libertados no meio extracelular foram quantificados usando ensaios de bioluminescência e de colorimetria, respetivamente. Para determinar o papel dos hemicanais (HC) e dos recetores P2X7 na libertação destes gliotransmissores, em condições não patológicas e do tipo-DA, recorremos ao bloqueio farmacológico destes mecanismos com o inibidor carbenoxolone (CBX) e o antagonista Brilliant Blue G (BBG), respetivamente. A potencial participação dos A2AR na modulação da libertação de ATP e de glutamato pelos astrócitos foi avaliada usando o antagonista seletivo destes recetores, SCH 58261. Neste estudo observámos um aumento na libertação de ambos os gliotransmissores estudados, ATP e glutamato, por astrócitos expostos a peptídeos Aβ1-42. Além disso, o ATP, mas não o glutamato, parece ser libertado principalmente por HC e parcialmente por recetores P2X7 em condições de DA. Demonstrámos também que a libertação de ATP pelos astrócitos era modulada pelos A2AR, porém estes recetores não regulavam a libertação de glutamato nestas células. Adicionalmente, mostrámos que exposição a peptídeos Aβ1-42 (24 horas) aumentou os níveis de conexina 43 (Cx43), que é a principal proteína constituinte dos HC nos astrócitos, e este efeito foi prevenido pelo bloqueio de A2AR, sugerindo uma modulação dos Cx43 HC pelos A2AR. Esta modulação foi validada pela observação de uma proximidade física entre os A2AR e a proteína Cx43, através de uma metodologia designada em inglês como “Proximity ligand assay (PLA)”No seu todo, os nossos resultados mostram que os peptídeos Aβ1-42 aumentam a libertação de ATP e de glutamato, e que a libertação destes gliotransmissores ocorre por mecanismos distintos. A libertação de ATP em condições de AD ocorreu principalmente através de HC e é modulada por A2AR, sendo que esta modulação talvez ocorra devido aos A2AR estarem associados fisicamente às Cx43. Estas descobertas podem contribuir para elucidar o impacto dos astrócitos na patogénese de DA e abrir caminho para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas contra esta doença neurodegenerativa.

Alzheimer’s disease (AD) is the leading cause of dementia among the elderly. The first signs of this disease involve memory loss, which begins with cortical accumulation of amyloid-β peptides (Aβ) that is thought to underlie synaptic dysfunction and loss. Currently, it is considered that astrocytes, the most abundant cells in the brain, are the third element of synapse, having a key role in control of neuronal excitability, especially in shaping synaptic plasticity, the neurophysiological basis of memory. However, albeit reactivity of astrocytes has been described in early AD, it remains to be clarified if the modification of astrocytic function affects the onset and progression of AD. Astrocytes modulate the synaptic function by the uptake of neurotransmitters, glutamate and GABA from synaptic cleft, and also by the release of gliotransmitters, such as glutamate and ATP. Thus, alterations in gliotransmission may contribute to synaptic dysfunction and subsequent neurodegeneration. However, it remains to be established how astrocytic ATP and glutamate release are affected in AD conditions, and the mechanisms underlying their release. Furthermore, previous studies from our group showed that astrocytes have adenosine A2A receptors (A2AR), which have also been implicated in AD pathogenesis, since the blockade of these receptors prevents not only synaptotoxicity but also astrocyte reactivity and dysfunction triggered by Aβ peptides. In this study, we aim to investigate: i) how AD conditions affect the release of ATP and glutamate by astrocytes, ii) the putative mechanisms involved in the release of these gliotransmitters, and iii) the role of astrocytic A2AR in controlling ATP and glutamate release. To achieve these goals, we used primary cultures of astrocytes from cortical brain of Wistar rats that were exposed acutely (1 hour) or chronically (24 hours) to Aβ1-42 peptides (1µM). The levels of ATP and glutamate released in extracellular medium were quantified using bioluminescence and colorimetric assays, respectively. To determine the role of hemichannels (HC) and P2X7 receptors in gliotransmitters release, in non-pathological and in AD-like conditions, we resort to the pharmacological blockade of these pathways by the inhibitor carbenoxolone (CBX) and by the antagonist Brilliant Blue G (BBG), respectively. The potential participation of A2AR in the modulation of astrocytic ATP and glutamate release was evaluated using the selective antagonist of A2AR, SCH 58261. We observed an increase in both gliotransmitters release, ATP and glutamate, in astrocytes exposed to Aβ1-42 peptide. Moreover, ATP but not glutamate, seems to be released mainly through HC and partially by P2X7 receptors in AD-like conditions. In addition, we also demonstrated a modulation of astrocytic ATP, but not of glutamate, release by A2AR. Furthermore, we showed that Aβ1-42 peptide (24 h exposure) increased the levels of connexin 43 (Cx43), which is the main component of HC in astrocytes, and that this effect was prevented by A2AR blockade, suggesting a modulation of Cx43 HC by A2AR. This modulation was further validated by the finding of a close proximity between the A2AR and the Cx43 protein, using the proximity ligand assay (PLA).Taken together, our results show that Aβ peptides increased astrocytic ATP and glutamate release, and that the release of these gliotransmitters occurred by distinct mechanisms. The release of ATP in AD-like conditions occurred mainly through HC, and is modulated by A2AR, probably due to a physical interaction of this receptor with Cx43. These findings may contribute to elucidate the impact of astrocytes on AD pathogenesis, and pave the way to develop novel therapeutic strategies against this neurodegenerative disorder.