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Title: Marcadores biológicos na esclerose múltipla: relevância no prognóstico e terapêutica
Authors: Valado, Ana Maria de Figueiredo 
Orientador: Moreno, António
Baldeiras, Inês
Keywords: EM; BOC IgG e IgM; MMPs; TIMPs; CAMs; BHE; prognóstico; LCR; polimorfismo -1562 C/T; MS; IgG and IgM-OCB; BBB; prognosis; CSF; -1562 C/T polymorphism
Issue Date: 15-May-2018
Citation: VALADO, Ana Maria de Figueiredo - Marcadores biológicos na esclerose múltipla : relevância no prognóstico e terapêutica. Coimbra : [s.n.], 2018. Tese de doutoramento. Disponível na WWW: http://hdl.handle.net/10316/80037
Place of publication or event: Coimbra
Abstract: Esclerose múltipla (EM) é uma doença multifatorial, inflamatória, desmielinizante e neurodegenerativa, com interrupção da transmissão nervosa no SNC. De etiologia pouco conhecida, uma reação autoimune direcionada contra antigénios da substância branca e auto-reatividade de células imunes através da BHE, mostraram ser cruciais na formação das lesões inflamatórias. O curso clínico da doença é altamente incerto, associando formas clínicas surto-remissão (SR) com formas progressivas. A heterogeneidade clínica e fisiopatológica torna o prognóstico da EM um desafio. O objetivo deste estudo foi tentar identificar marcadores biológicos que funcionassem como indicadores de prognóstico da EM. Para tal selecionaram-se marcadores que se sabe terem um papel essencial na inflamação do SNC: MMPs e seus inibidores (TIMPs), moléculas de adesão celular (CAMs), produção intratecal de imunoglobulinas (Ig). Estudaram-se amostras emparelhadas de LCR e soro de doentes de EM e controlos neurológicos (CN: outras doenças inflamatórias-DI e não inflamatórias-DNI do SNC), onde se pesquisou a presença de bandas oligoclonais (BOC) IgG e IgM por focagem isoelétrica. Os níveis de MMP-2, MMP-9, TIMP-2, TIMP-1, sICAM-1, sVCAM-1 e sE-Seletina, foram determinados por ELISA. Recorrendo à metodologia PCR-RFLP, avaliou-se a presença do polimorfismo -1562 C/T do gene da MMP-9 em doentes de EM e controlos saudáveis (CS). As BOC IgG pesquisaram-se em 183 doentes de EM e 76 CN, revelando um predomínio de IgG restritas ao LCR em 82,4%, nos doentes de EM e em 15,8% dos controlos. Quanto à progressão da incapacidade no curso da EM, avaliada pela escala de EDSS, revelou-se significativamente superior após o primeiro ano de EM nos doentes com BOC IgG positivas. Porém, esta tendência inverteu-se ao longo da doença, e numa avaliação superior a 10 anos de EM, os valores de EDSS tornaram-se significativamente superiores nos doentes sem BOC IgG, apresentando também valores superiores e significativos no último EDSS, uma maior probabilidade de atingirem um valor de EDSS≥4 após 10 anos de EM ou de alguma vez, durante o curso da EM, atingirem um EDSS≥6. Observaram-se também diferenças significativas em relação aos subtipos, com os doentes na forma primária progressiva a mostrarem uma percentagem menor de BOC IgG positivas, e às terapêuticas instituídas, com os doentes sem BOC IgG a registarem maior necessidade de recorrer a terapia de 2ª linha. Relativamente às BOC IgM (pesquisadas em 115 doentes de EM e 69 CN), apenas 16,5% nos doentes de EM revelaram a presença de BOC IgM restritas ao LCR, sem diferença significativa face aos controlos. Os doentes de EM com BOC IgM positivas evidenciaram, à data da PL, um EDSS significativamente superior e também uma maior probabilidade de atingirem alguma vez, ao longo da doença, um valor de EDSS≥6. Os marcadores de disfunção da BHE foram avaliados num subgrupo de 51 doentes de EM, 21 DNI e 33 DI. Observou-se um aumento significativo nos níveis da MMP-2 sérica, da razão MMP-2/TIMP-2 no soro e LCR, da razão MMP-9/TIMP-1 no LCR e, ainda, uma redução significativa nos níveis do TIMP-2 sérico nos doentes de EM. Quanto às CAMs, observou-se um aumento significativo da sICAM-1 e sE-Seletina e uma redução da sVCAM-1 no LCR dos doentes de EM. Quanto à relação com a progressão da EM, o aumento da expressão da sVCAM-1 sérica revelou uma associação com níveis superiores de EDSS e formas progressivas da EM; enquanto um aumento da razão MMP-9/TIMP-1 sérica mostrou associar-se a menor incapacidade no curso da EM e ao fenótipo SR. O estudo do polimorfismo -1562 C/T no gene da MMP-9 realizou-se em 169 doentes de EM e 186 CS, sem diferenças significativas na distribuição entre doentes e controlos. Contudo, nos doentes e não nos controlos, registou-se um aumento significativo da frequência do alelo T no sexo feminino. Não se observou nenhuma associação entre a presença do polimorfismo -1562 C/T e a progressão da EM. Os níveis séricos da MMP-9 eram significativamente superiores nos doentes, não sendo influenciados pela presença do alelo T, ao contrário do observado nos CS, onde o alelo T estava associado ao aumento dos níveis da MMP-9. Registou-se ainda uma redução significativa nos níveis séricos da MMP-9 nos doentes a realizar terapia com IFNβ. Os nossos resultados sugerem que alguns dos marcadores possam ter utilidade clínica no seguimento dos doentes de EM. A síntese intratecal de IgG e IgM parece ter efeito preditivo no curso da EM, com a ausência de IgG no LCR a apontar para um pior prognóstico a longo prazo e a presença de IgM a sugerir um prognóstico menos favorável a curto prazo. Também níveis elevados de sVCAM-1 séricos parecem sugerir um fenótipo mais agressivo, enquanto o aumento da razão MMP-9/TIMP-1 aparece associado a menor incapacidade ao longo da EM e poderá ser um bom marcador de resposta à terapêutica nos doentes tratados com o IFNβ.
Multiple sclerosis (MS) is a multifactorial, inflammatory, demyelinating and neurodegenerative disease, with interruption of nerve transmission in the central nervous system (CNS). Despite unknown aetiology, an autoimmune reaction directed against white matter antigens and self-reactivity of immune cells through the blood-brain barrier (BBB), have been shown to be crucial to the formation of inflammatory lesions. The clinical course of the disease is highly unpredictable, with both relapsing-remitting (RR) and progressive forms. The clinical and pathophysiological heterogeneity make MS prognosis very challenging. The objective of this study was to identify biological markers that would act as prognostic markers of MS. Therefore, we selected markers known to play an essential role in CNS inflammation: matrix metalloproteinases (MMPs) and their inhibitors (TIMPs), cell adhesion molecules (CAMs), and the intrathecal production of immunoglobulins (Ig). Paired cerebrospinal fluid (CSF) and serum samples from MS patients and neurological controls (NC: other inflammatory diseases-ID and non-inflammatory of the CNS-NID) were studied, and the presence of IgG and IgM oligoclonal bands (OCB) was assessed by isoelectric focusing. The levels of MMP-2, MMP-9, TIMP-2, TIMP-1, sICAM-1, sVCAM-1 and sE-Seletin were determined by ELISA. The presence of the -1562 C/T polymorphism of the MMP-9 gene was also evaluated in MS patients and healthy controls (HC), through PCR-RFLP methodology. The presence of IgG-OCB was investigated in 183 MS patients and 76 controls (37-NID; 39-ID), showing a predominance of CSF restricted IgG-OCB in 82.4% of MS patients and in 15.8% of controls. Regarding the progression of disability in the course of MS, assessed through the EDSS scale, significantly increased levels were found after the first year of MS in IgG-OCB positive patients. However, this trend reversed over the disease course, and after 10 years or more of MS, EDSS values became significantly higher in patients without IgG-OCB, that also presented significantly higher values in the last EDSS, a higher probability of reaching an EDSS≥4 after 10 years of MS or of reaching an EDSS≥6 at any time during the course of MS. Significant differences were also observed regarding clinical subtypes, with patients in the progressive primary form showing a lower percentage of positive IgG-OCB, and in relation to therapy, with patients without IgG-OCB being more likely to undergo second line therapy. In relation to IgM-OCB (investigated in 115 MS patients and 69 NC), 16.5% of MS patients showed CSF restricted IgM-OCB, with no significant difference in relation to controls. MS patients with positive IgM-OCB showed, at the time of LP, a significant higher EDSS score and also an increased probability of reaching an EDSS≥6 over the course of the disease. BBB dysfunction markers were evaluated in a subgroup of 51 MS, 21 NID and 33 ID patients. A significant increase in serum MMP-2, serum and CSF MMP-2/TIMP-2 ratio, CSF MMP-9/TIMP-1 ratio, as well as a significant reduction in serum TIMP-2 levels was found in MS patients. Regarding CAMs, a significant increase of sICAM-1 and sE-Seletine and a reduction of sVCAM-1 in the CSF of MS patients was observed. Regarding the relation with the progression of MS, increased serum sVCAM-1 expression was associated with higher EDSS scores and progressive forms of MS; while an increase in the serum MMP-9/TIMP-1 ratio was associated with lower disability in the course of MS and the SR phenotype. The study of the -1562 C/T polymorphism in the MMP-9 gene was performed in 169 patients with MS and 186 CS, showing no significant difference between patients and controls. However, in patients, but not in controls, an increase in the frequency of the T allele in females was found. There was no association between the presence of the -1562 C/T polymorphism and the progression of MS. Serum levels of MMP-9 were increased in MS patients and were not influenced by the presence of the T allele, contrary to what was shown in HC, where the T allele was associated with increased levels of MMP-9. There was also a significant reduction in serum MMP-9 levels in patients undergoing IFNβ therapy. Our results suggest that some of the tested markers may have clinical utility in the follow-up of MS patients. The intrathecal synthesis of IgG and IgM seems to have a predictive value in the course of MS, with the absence of IgG-OCB in the CSF pointing towards a worse long term prognosis and the presence of IgM-OCB suggesting a less favourable prognosis in the short term. Also, elevated serum sVCAM-1 levels appear to be indicative of a more aggressive phenotype, while increased MMP-9/TIMP-1 ratio seems to be associated with decreased disability throughout MS and may be a good marker of response to therapy in patients treated with IFNβ.
Description: Tese de doutoramento em Biociências, no ramo de Biologia Celular e Molecular, apresentada ao Departamento de Ciências da Vida, da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra
URI: http://hdl.handle.net/10316/80037
Rights: embargoedAccess
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