Dequalinium : a new approach on leukaemia treatment?

Abstract

Haematologic malignancies are neoplasias that arise from a disturbance in the normal hematopoietic process and are increasingly common. Current cancer therapies seek to induce cell death, but the lack of specificity for cancer cells limits its efficacy. The primary function of mitochondria is oxidative phosphorylation, however this process induces Reactive Oxygen Species (ROS) production which has a relevant role in inducing cell proliferation and death. Delocalized lipophilic cations (DLCs) penetrate the hydrophobic barriers of the plasma and mitochondrial membranes and accumulate in mitochondria in response to the negative transmembrane potentials. The higher plasma and/or mitochondrial membrane potentials of neoplastic vs. normal cells, in general, account for greater uptake of these compounds in neoplastic cells. Dequalinium (DQA) is a DLC that interferes with the mitochondria and so our goal is to evaluate the therapeutic potential of DQA in several haematological malignancies, namely in B-cell Chronic Lymphocytic Leukaemia (B-CLL), Chronic Myeloid Leukemia (CML), Myelodysplastic Syndrome (MDS), Acute Promyelocytic Leukaemia (APL) and Diffuse Large B Cell Lymphoma (DLBCL). For this purpose we treated five haematological cancer cell lines, the EHEB (B-CLL), K562 (CML), F36P (MDS), HL-60 (APL) and Farage (DLBCL) cells, with different concentrations of DQA either by single dose administration or by daily dose administration, in monotherapy and/or in association with conventional anticarcinogenic agents. Flow cytometry was used to evaluate the mitochondrial membrane potential, the levels of ROS (H2O2; O2 •-), the antioxidant defense, Reduced Glutathione (GSH), and the levels of caspase 3, cytochrome c, Cyclin D1 and p53. Our results show that DQA induces a decrease in cell viability inducing cell death by late apoptosis/necrosis in a time, dose and cell type dependent manner. The most sensitive cells appear to be the K562, Farage and HL-60 cells (IC50 of 2,5 μM), followed by the F36P (IC50 of 5 μM) and the least sensitive being the EHEB cells (IC50 between 5 and 7,5 μM). Our results suggest that the therapeutic combination of DQA with FDN, Imatinib, Ara-C and ATRA, respectively in EHEB, K562, F36P and HL-60 cells, increases the cytotoxic effect observed for the same compounds alone. The daily dose administration seems to be the better therapeutic strategy for F36P and HL-60 cell lines, since it allows an overall lower dose usage. These effects may be mediated by oxidative stress as we have observed and increase in ROS production and a decrease in GSH levels and in the mitochondrial membrane potential. Moreover, an increase in caspase 3 and cytochrome c indicate an activation of the intrinsic apoptotic pathway, which may be modulated by p53, whose levels were significantly higher in the EHEB, the K562 and the HL-60. Cyclin D1 was also found to be elevated in the K562 cells. In summary, our results suggest that DQA may be used as new therapeutic approach in haematological neoplasias both in monotherapy and in association with the conventional therapy.

As neoplasias hematológicas são doenças que se originam a partir de alterações no normal processo de diferenciação hematopoiética e são cada vez mais comuns. As actuais terapias para o cancro tentam induzir morte celular mas a falta de especificidade para a célula tumoral limita a sua eficácia. A principal função mitocondrial é a fosforilação oxidativa, no entanto, este processo induz a síntese de espécies reactivas de oxigénio (ROS) que têm um papel importante na indução de proliferação e/ou morte celulares. Os catiões lipofílicos possuindo uma carga positiva deslocalizada (DLCs) penetram as barreiras hidrofóbicas das membranas citoplasmática e mitocondrial para se acumularem na mitocôndria em resposta ao seu potencial transmembranar negativo. O facto das células neoplásicas terem maior potencial de membrana citoplasmático e/ou mitocondrial em relação às células normais, pode permitir uma maior acumulação destes compostos nas células neoplásicas. O Dequalinium (DQA) é um DLC que interfere com a mitocôndria e, assim, o nosso objectivo é avaliar o potencial terapêutico do DQA em neoplasias hematológicas, nomeadamente em Leucemia Linfocítica Crónica (LLC), Leucemia Mielóide Crónica (LMC), Síndrome Mielodisplásico (SMD), Leucemia Promielocítica Aguda (LPA) e Linfoma Difuso de Grandes Células B (LDGCB). Para atingirmos este objectivo utilizámos cinco linhas celulares, incubámos as células EHEB (LLC), K562 (LMC), F36P (SMD), HL-60 (APL) e Farage (LDGCB), com diferentes concentrações de DQA quer em administração de dose única, quer por administração diária, em monoterapia e/ou em associação com a terapêutica anticancerígena convencional. Recorremos à citometria de fluxo para avaliar o potencial de membrana mitocondrial, os níveis de ROS (H2O2; O2 •-), da defesa antioxidante Glutationa Reduzida (GSH) e dos níveis de caspase 3, citocromo c, ciclina D1 e p53. Os nossos resultados mostram que o DQA induz diminuição da viabilidade celular por apoptose tardia/necrose num modo dependente de tempo, de dose e do tipo celular. As linhas celulares mais sensíveis parecem ser as K562, as Farage e as HL-60 (IC50 de 2,5 μM), seguidas pelas F36P (IC50 de 5 μM) e por fim as menos sensíveis EHEB (IC50 entre 5 e 7,5 μM). Os nossos resultados sugerem que a associação de DQA com FDN, Imatinib, Ara-C e ATRA, respectivamente nas EHEB, K562, F36P e HL-60, aumenta o efeito citotóxico observado para os mesmos compostos sozinhos. A adição diária parece ser a melhor estratégia terapêutica para as F36P e para as HL-60, visto que permite o uso de uma dose menor. Estes efeitos parecem ser mediados por indução de stress oxidativo, uma vez que observámos um aumento de ROS e uma diminuição dos níveis de GSH e do potencial de membrana mitocondrial. Esta perda do potencial mitocondrial e o aumento de caspase 3 e citocromo c indicam uma activação da via intrínseca da apoptose, que pode ser modulada pela proteína p53, cujos níveis estavam significativamente aumentados nas células EHEB, K562 e HL-60. Também observamos um aumento dos níveis de ciclina D1 nas células K562. Em resumo, os nossos resultados sugerem que o DQA pode ser utilizado como nova abordagem terapêutica em neoplasias hematológicas tanto em monoterapia como em associação com a terapêutica convencional.