Quantification of tramadol and M1 in post mortem samples by gas chromatography-ion trap mass spectrometry and preliminary pharmacogenomic studies

Abstract

Tramadol is a centrally acting opioid analgesic, widely used for moderate to severe pain due to its efficacy and safety. Although tramadol induce less adverse effects compared to other opioids, serious complications can occur in case of intoxication. The intoxication by this drug it is also common in individuals with an abuse history of opioids, despite its low potential in developing dependence. Moreover, the administration of toxic doses of tramadol concomitantly with other central nervous system depressants is one of the most common causes of severe or lethal acute intoxication. Currently, several analytical techniques are being used to quantify tramadol and its main pharmacologically active metabolite, O-desmethyltramadol (M1) in ante mortem specimens, namely in plasma, blood, saliva, urine and hair. However, in post mortem samples, there are few studies that evaluate the importance of M1 in the cause of death and the importance of polymorphism in the pharmacokinetics of tramadol. This work aimed the optimization and validation of an analytical method for the detection and quantification of tramadol and M1 in post mortem blood samples by gas chromatography-ion trap mass spectrometry (GC-IT/MS). The same blood specimens were addressed to study cytochrome P450 2D6 (CYP2D6), multidrug resistance protein 1 (MDR1), μ-opioid receptor gene (OPRM1) and catechol-O-methyltransferase (COMT) single nucleotide polymorphisms (SNP) by real-time polymerase chain reaction (PCR). The Part I of this dissertation describes the use and therapeutic applicability of tramadol as well as considerations about pharmacokinetic and pharmacodynamic of tramadol and M1. A review of the literature was also made on tramadol intoxications and validated analytical methods to quantify tramadol and metabolites in several biological matrices. Special consideration is devoted to the importance of pharmacogenomics in the interpretation of forensic and clinical toxicological results. The Part II is reserved for the general and specific objectives of this work. In Part III the experimental work is described according with the proposed objectives, as well as the method validation, its application to real cases of post mortem blood samples and genotyping and phenotyping analysis. In Part IV all references consulted for the present work are presented. The GC-IT/MS method described in this study exhibited a good selectivity, lower limit of detection (LOD) and lower limit of quantification (LLOQ) (0.74 and 0.56 ng/mL for tramadol and 2.24 and 1.70 ng/mL for M1 respectively) in a matrix with relevant importance in forensic toxicological analysis. The regression analysis for both analytes showed linearity in the range 5-1000 ng/mL with determination coefficients (r2) ranging from 0.9991 to 0.9999. The coefficients of variation (%CV) oscillated between 0.70 and 12.45%. This method was then successfully applied for the quantification of tramadol and M1 in real post mortem blood samples from five cases of suspected tramadol fatal intoxications. Regarding polymorphism studies, four subjects with at least one functional allele were categorized as extensive metabolizers (EMs). Nevertheless it was not possible to establish any comparison between polymorphic results and concentrations of tramadol and M1, due to the much reduced number of samples. In addition, high tramadol concentrations could not be completely explained only based on polymorphisms studied. Besides pharmacogenomics, the pharmacokinetics of the drug can be affected by many other factors namely, age, disease, concomitant medication, metabolic interactions and kidney or liver function. One of the five cases was not possible to determine the genotype. In this case, it is important to consider the possibility of being a poor metabolizer (PM) subject for rare mutations that are extremely uncommon in Caucasians, which could not be identified with the assay used. In conclusion it was develop and validate a GC-IT/MS method to quantify tramadol and M1 in post mortem blood samples. Moreover, 4 polymorphisms were applied in blood samples. If further samples were available, interesting correlations were expected to be obtained. Nevertheless, the methods were validated and are ready to be routinely used in forensic aplications.

O tramadol é um analgésico opióide de ação central, muito utilizado para a dor moderada a severa devido à sua eficácia e segurança. Apesar do tramadol induzir menores efeitos adversos comparativamente com outros opióides, podem ocorrer complicações graves em caso de intoxicação. A intoxicação por este fármaco é também comum em indivíduos com um historial de abuso de opióides, apesar do seu baixo potencial de desenvolvimento de dependência. No entanto, a administração de doses tóxicas de tramadol, concomitantemente com outros depressores do sistema nervoso central, é uma das causas mais comuns de intoxicação aguda grave ou letal. Atualmente, várias técnicas analíticas estão disponíveis para quantificar o tramadol e o seu principal metabolito O-desmetiltramadol (M1), farmacologicamente activo, em amostras ante mortem, nomeadamente em plasma, sangue, saliva, urina e cabelo. Contudo, em amostras post mortem, são escassos os estudos que avaliaram a importância do M1 na causa de morte e a importância do polimorfismo na farmacocinética do tramadol. Este trabalho teve como objetivo a otimização e a validação de um método analítico por cromatografia gasosa acoplada a espetrometria de massa com “ion-trap” (GC-IT/MS), para a deteção e quantificação de tramadol e M1 em amostras de sangue post mortem. As mesmas amostras de sangue foram utilizadas para estudar os polimorfismos de nucleótido único (SNP) nos genes do citocromo P450 2D6 (CYP2D6), proteína de resistência a múltiplas drogas (MDR1), gene do recetor μ-opióide (OPRM1) e catecol O-metiltransferase (COMT) pela reacção em cadeia da polimerase (PCR) em tempo-real. Na Parte I da presente dissertação aborda a aplicabilidade terapêutica do tramadol assim como o estado de arte relativo à farmacocinética e farmacodinâmica do tramadol e M1. Procedeu-se também à revisão da literatura sobre as intoxicações por tramadol e métodos analíticos validados para a quantificação de tramadol e metabolitos em várias matrizes biológicas. Especial consideração é dada à importância da farmacogenómica na interpretação dos resultados toxicológicos forenses e clínicos. Na Parte II encontram-se definidos os objetivos gerais e específicos deste trabalho. Na Parte III o trabalho experimental é descrito de acordo com os objetivos propostos, assim como a validação do método desenvolvido, a sua aplicação em casos reais de sangue post mortem e análises de genotipagem e fenotipagem. Na Parte IV estão descritas todas as referências bibliográficas consultadas para a realização do presente trabalho. O método de GC-IT/MS descrito neste estudo exibiu uma boa seletividade, baixo limite de detecção (LOD) e baixo limite de quantificação (LLOQ) (0.74 e 0.56 ng/mL para o tramadol e 2.24 e 1.70 ng/mL para o M1 respetivamente), numa matriz com importância relevante na análise toxicológica forense. As análises de regressão para ambos os analitos mostraram linearidade no intervalo 5-1000 ng/mL com coeficientes de determinação (r2) que variaram de 0.9991 a 0.9999. Os coeficientes de variação (CV%) oscilaram entre 0,70 e 12,45%. Este método foi aplicado com sucesso para a quantificação do tramadol e M1 em amostras reais de sangue post mortem de cinco casos de suspeita de intoxicação fatal por tramadol. Em relação aos estudos dos polimorfismos, quatro indivíduos foram classificados como metabolizadores extensos (EMs). No entanto, não foi possível estabelecer qualquer comparação entre os resultados dos polimorfismos e concentrações de tramadol e M1, devido ao número muito reduzido de amostras. Para além disso, as concentrações elevadas de tramadol não podem ser completamente explicadas apenas com base nos polimorfismos estudados. Além da farmacogenómica, a farmacocinética do fármaco pode ser afetada por muitos outros fatores, como por exemplo idade, doença, medicação concomitante, interações metabólicas e função renal ou hepática. Num dos cinco casos, não foi possível determinar o genótipo. Neste caso, é importante ter em conta a possibilidade de ser um sujeito metabolizador pobre (PM) para mutações que não são comuns em Caucasianos, que não puderam ser identificados com a análise realizada. Em conclusão, foi desenvolvido e validado um método de GC-IT/MS para quantificar o tramadol e M1 em amostras de sangue post mortem. Além disso, quatro polimorfismos foram aplicados em amostras de sangue. Se outras amostras estivessem disponíveis, seria de esperar obter melhores correlações. No entanto, os métodos foram validados e estão prontos para ser utilizados rotineiramente em aplicações forenses.