Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10316/44084
Title: Regulation of synaptic transmission by BDNF : effects on NMDA receptor-mediated mEPSCs
Authors: Luca, Pasqualino De 
Orientador: Duarte, Carlos
Mele, Miranda
Keywords: Plasticidade sináptica; Receptores NMDA; mEPSC; Neurotrofinas; BDNF
Issue Date: 2016
Place of publication or event: Coimbra
Abstract: Brain derived neurotrophic factor (BDNF) plays an important role in long-term synaptic potentiation (LTP) in the hippocampus, partially due to the upregulation of translation activity. However, the molecular mechanisms are not fully understood. In this work we investigated the effect of BDNF of the surface expression of N-methyl-D-aspartate receptors, which play a key role in synaptic plasticity. Stimulation of cultured hippocampal neurons with BDNF induced the synaptic accumulation of GluN2B-containing NMDAR, as determined by immunocytochemistry with an antibody against the N-terminal region of the receptor subunit and by colocalization with pre- and post-synaptic markers, the vesicular glutamate transporter type 1 (vGlut1) and postsynaptic density protein 95 (PSD-95), respectively. The effect of BDNF on the amplitude and frequency of NMDAR mediated miniature excitatory postsynaptic currents (mEPSCs) was also evaluated under the same conditions by voltage-clamp recordings. Incubation of cultured hippocampal neurons with BDNF upregulated the amplitude of NMDA receptor-mediated mEPSC, but did not change the rise and decay time. The enhancement in the amplitude of the currents was abrogated by the GluN2B competitive antagonist Conantokin G, in agreement with the results obtained in the immunocytochemistry experiments. Antibody-feeding experiments showed no significant alteration in the rate of internalization of GluN2B-containing NMDA receptors following incubation of the neurotrophin, suggesting that a different mechanism is involved. The BDNF-evoked upregulation of GluN2B surface expression, as well as the increase in the amplitude of mEPSC, were abrogated by the protein synthesis inhibitor cycloheximide, suggesting a role for local translation activity. Based on unpublished observations from the laboratory showing a key role for the hnRNP K (heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K) RNA binding protein in the regulation of protein synthesis by BDNF, we characterized the role of this protein in the neurotrophin-induced upregulation of NMDA receptor mediated mEPSC. Transfection of hippocampal neurons with an shRNA against hnRNP K suppressed the effects of BDNF on the amplitude of mEPSC. Considering the available evidence showing that BDNF upregulates Pyk2 protein levels in hippocampal neurons by a mechanism dependent on hnRNP K, we hypothesized that de novo synthesis of the kinase could play a role in the regulation of the synaptic expression of GluN2B-containing NMDA receptors by BDNF. Transfection of hippocampal neurons with an shRNA specific for Pyk2 abrogated the BDNF-evoked increase in the amplitude of the NMDA receptor-mediated mEPSC, showing a role for the kinase as a mediator of the TrkB-BDNF signaling to regulate the activity of NMDA receptors. BDNF also increased the frequency of NMDA receptor mediated mEPSC in cultured hippocampal neurons, by a mechanism sensitive to cycloheximide and possibly dependent on the presence of hnRNP K. This shows a presynaptic response to BDNF in glutamatergic synapses, which requires protein synthesis. Together, the results show a novel effect of BDNF in the regulation of the synaptic expression of NMDA receptors that is mediated by the RNA binding protein hnRNP K, as well as by the Pyk2 tyrosine kinase. These alterations in the surface expression of NMDA receptors may play an important role in LTP in the hippocampus.
O factor neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) desempenha um papel importante na potenciação sináptica de longa duração (LTP) no hipocampo, em parte através da regulação da síntese proteica. No entanto, os mecanismos moleculares envolvidos não estão inteiramente esclarecidos. Neste trabalho investigámos o efeito do BDNF na expressão superficial dos receptores do glutamato do tipo N-metil-D-aspartato (NMDAR), os quais desempenham um importante papel nos mecanismos de plasticidade sináptica. A estimulação de neurónios do hipocampo em cultura com BDNF induziu a acumulação sináptica de receptores NMDA contendo a subunidade GluN2B, detectada com recurso a experiências de imunicitoquímica usando um anticorpo com afinidade para o terminal amínico desta subunidade (domínio extracelular), e através da colocalização com os marcadores pré- (transportador vesicular do glutamato [vGlut1]) e pós- sinápticos (PSD-95). O efeito do BDNF na amplitude e na frequência das correntes miniatura excitatórias pós-sinápticas espontâneas (mEPSCs) foi estudado através de voltage-clamp. A estimulação com BDNF aumentou a amplitude das mEPSCs mediada pelos receptores NMDA, não tendo sido observado qualquer efeito no tempo de elevação e de decaimento das correntes. O aumento da amplitude das mEPSCs em resposta ao BDNF foi inibido na presença do antagonista competitivo para a subunidade GluN2B, Conantoquina G, de acordo com os resultados obtidos nas experiências de imunocitoquimica. Ensaios utilizando a técnica de antibody-feeding mostraram que não existe qualquer alteração estatisticamente significativa na taxa de internalização dos receptores NMDA contendo a subunidade GluN2B em neurónios incubados com BDNF, o que sugere a participação de um mecanismo alternativo nas alterações da expressão superficial dos receptores. O aumento da expressão superficial das subunidades GluN2B, bem como das mEPSCs, em neurónios estimulados com BDNF, foram completamente inibidos na presença do inibidor da síntese proteica cicloheximida, sugerindo um papel importante da síntese proteica na resposta à estimulação com a neurotrofina. Tendo em conta resultados não publicados do nosso laboratório que mostram um papel importante da hnRNP K (ribonucleoproteína nuclear heterogénea do tipo K) na regulação da síntese proteica promovida pelo BDNF, caracterizámos a função desta proteína no aumento das mEPSCs mediadas pelos receptores NMDA em resposta à estimulação com BDNF. O efeito da neurotrofina no aumento das mESPCs foi suprimido em neurónios infectados com um shRNA específico para a hnRNPK. Tendo em conta estudos anteriores que mostraram um aumento dos níveis da proteína Pyk2 em neurónios de hipocampo estimulados com BDNF, por um mecanismo dependente de hnRNPK, colocámos a hipótese da síntese de novo da cinase representar um passo essencial na regulação da expressão sináptica dos receptores NMDA contendo a subunidade GluN2B em resposta à estimulação com BDNF. A transfecção de neurónios do hipocampo com um shRNA específico para a Pyk2 anulou o efeito do BDNF nas mEPSC mediadas pelos receptores NMDA, demonstrando um papel central desta cinase na sinalização pelo complexo TrkB-BDNF e na regulação da actividade dos recetores NMDA. Foi também observado um aumento na frequência das mEPSC mediada pelos receptores NMDA em resposta ao BDNF, através de mecanismo sensível à ciclohexamida. Estes resultados mostram um efeito pré-sinaptico do BDNF nas sinapses glutamatérgicas, bem como a necessidade da síntese proteica para a ocorrência destas alterações. Além disso, os resultados obtidos mostraram que o efeito do BDNF requer a presença da hnRNPK. Em conclusão, os resultados obtidos mostram um efeito nunca reportado do BDNF na expressão sináptica dos recetores NMDA, e em particular o papel da hnRNPK e da Pyk2 como intermediários nestes efeitos da neurotrofina. Estas alterações na expressão superficial dos recetores NMDA deverão desempenhar um papel importante na regulação da LTP no hipocampo.
URI: http://hdl.handle.net/10316/44084
Rights: openAccess
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