Avaliar a evolução da suscetibilidade in vitro ao artesunato e artemeter e do perfil genótípico de potenciais marcadores genéticos de resistência em populações naturais de plasmodium falciparum do norte deo Brasil

Abstract

A malária continua a ser uma das maiores ameaças para a saúde pública e desenvolvimento económico das regiões tropicais e subtropicais do mundo. Em 2010, causou 216 milhões de casos de doença e aproximadamente 655 000 mortes. No Brasil cerca de 20% da população vive em zonas de risco de transmissão, sendo o Estado do Pará onde ocorre o maior número de casos. Uma das medidas de controlo da doença é o recurso a antimaláricos. No entanto, a resistência do Plasmodium falciparum à maioria dos antimaláricos em uso tornou-se num dos maiores obstáculos ao controlo eficaz da doença. Para contornar o problema da resistência aos antimaláricos a Organização Mundial de Saúde (O.M.S.) recomenda desde 2006 a combinação terapêutica com derivados da artemisinina (ACTs) como tratamento de primeira linha na malária não complicada por Plasmodium falciparum, sendo actualmente utilizada em 84 dos 106 países e territórios endémicos. No Brasil essa recomendação foi implementada em 2007, sendo usadas as combinações Artemeter/Lumefantrina e Artesunato/Mefloquina. Apesar de todos os esforços, a resistência aos ACTs já foi demonstrada no Cambodja, local onde surgiu também a resistência à cloroquina nos anos 50 e posteriormente à sulfadoxina-pirimetamina e à mefloquina, existindo também indícios da sua emergência em Myanmar, Tailândia e Vietname. Caso a resistência aos ACTs se alastre para outras áreas geográficas, como aconteceu com outros antimaláricos, as consequências serão catastróficas, uma vez que não haverá alternativas terapêuticas eficazes disponíveis nos próximos anos. Este facto faz com que a prevenção da disseminação da resistência e o controlo do seu aparecimento em novas áreas sejam fundamentais no combate eficaz da doença. A monitorização da resistência tem como finalidade a identificação precoce da resistência permitindo uma atuação atempada e eficaz, podendo ser realizada através da avaliação da suscetibilidade in vitro de populações naturais de P. falciparum e pelo estudo de marcadores moleculares de resistência. Apesar do mecanismo de resistência à artemisinina não estar esclarecido, os genes pfcrt, pfmdr1 e pfATPase6 têm sido investigados no contexto da modulação da suscetibilidade à artemisinina e seus derivados, existindo indícios do seu envolvimento por amplificação génica e mutações na sequência dos genes. Estes dados levam a que sejam utilizados como potenciais marcadores moleculares de resistência. Este projeto pretende realizar uma monitorização da resistência aos ACTs no Norte do Brasil, avaliando a evolução da suscetibilidade in vitro ao artesunato e artemeter e do perfil genotípico de potenciais marcadores genéticos de resistência, (genes pfcrt, pfmdr1 e pfATPase6), seis anos após a introdução dos ACTs como tratamento de primeira linha na malária não complicada por P. falciparum, tendo como referência de suscetibilidade in vitro basal e perfil genotípico um trabalho realizado por em 2005, antes da introdução oficial destas combinações terapêuticas. Desta forma pretende-se verificar se a introdução em larga escala dos ACTs alterou a suscetibilidade in vitro e perfil genotípico do P. falciparum nessa região. Os objetivos deste projeto são: 1-Avaliar a suscetibilidade in vitro ao artesunato e artemeter em isolados de Plasmodium falciparum do Estado do Pará, Brasil. 2- Pesquisar polimorfismos genéticos nos genes pfcrt, pfmdr1 e pfATPase6 por PCR-RFLP, em todos os isolados. 3-Pesquisar o número de cópias do gene pfmdr1 por PCR em Tempo Real nos isolados com menor suscetibilidade in vitro ao artesunato e artemeter. 4-Avaliar a correlação dos polimorfismos genéticos dos genes pfcrt, pfmdr1 e pfATPase6 com os valores da suscetibilidade in vitro ao artesunato e artemeter. 5-Avaliar a evolução da suscetibilidade in vitro ao artesunato e artemeter, comparando com os valores de suscetibilidade in vitro de 2005. 6-Avaliar a evolução do perfil genotípico, polimorfismos genéticos nos genes pfcrt, pfmdr1 e pfATPase6 e número de cópias do gene pfmdr1, utilizando como referência os resultados dum trabalho realizado em 2005. Os resultados deste projeto irão contribuir para um melhor controlo da malária, nomeadamente no contexto da resistência, indo ao encontro dos objetivos da O.M.S. na luta contra a resistência aos ACTs.

Malaria remains a major threat to public health and economic development of tropical and subtropical regions of the world. There were 216 million cases of malaria and nearly 655,000 deaths in 2010. In Brazil, about 20% of the population lives in areas at risk of transmission, and the Pará State count the largest number of cases. One of the measures of disease control is the use of antimalarials. However, resistance of Plasmodium falciparum to most antimalarials in use has become a major problem to effective disease control. To circumvent the problem of antimalarial drugs resistance the World Health Organization recommends since 2006 the artemisinin-based combination therapy (ACTs) as first-line treatment for uncomplicated malaria caused by Plasmodium falciparum, it is currently used in 84 of 106 countries and endemic areas. In Brazil this recommendation was implemented in 2007, the combinations used are Artemether / Lumefantrine and Artesunate / Mefloquine. Despite all efforts, ACTs resistance emerged in Cambodia, where it also emerged chloroquine resistance in the 50s and after sulfadoxine-pyrimethamine resistance and mefloquine resistance. There is also evidence of its emergence in Myanmar, Thailand and Vietnam. If ACTs resistance spreads to other geographic areas, as happened with other antimalarial drugs, the consequences will be catastrophic, since there are no effective treatment options available in the coming years. This fact makes the prevention of resistance spread and control of its emergence in new areas critical in effective fight against the disease. Monitoring the resistance aims an early identification of resistance allowing a timely and effective action; it can be performed by evaluating the in vitro susceptibility of natural populations of P. falciparum and the use of molecular markers of resistance. Although the mechanism of resistance to artemisinins is not understood, pfcrt, pfmdr1 and pfATPase6 genes have been investigated in the context of modulation of artemisinins susceptibility, there is evidence of their involvement by gene amplification and mutations in the gene sequence, reason why they have been used as potential markers of resistance. This project intends to monitor ACTs resistance in Northern Brazil, assessing the evolution of the in vitro susceptibility to artesunate and artemether and genotypic profile of potential genetic markers of resistance (pfcrt, pfmdr1 and pfATPase6 genes), six years after ACTs introduction as first-line treatment for uncomplicated malaria caused by Plasmodium falciparum, using as reference baseline in vitro susceptibility and genotypic profile a study made in 2005, before the official introduction of these combination therapies. Therefore we intend to check if the large-scale introduction of ACTs changed in vitro susceptibility and genotypic profile of P. falciparum in this region. The goals of this project are: 1-To evaluate the in vitro susceptibility to artesunate and artemether in Plasmodium falciparum isolates from Pará State, Brazil. 2 - Search for genetic polymorphisms in pfcrt, pfmdr1 and pfATPase6 genes using PCR-RFLP in all isolates. 3-To evaluate pfmdr1 gene copy number using real time PCR in the isolates with lower in vitro susceptibility to artesunate and artemether. 4-To evaluate the correlation between the genetic polymorphisms of pfcrt, pfmdr1 and pfATPase6 genes and the values of in vitro susceptibility to artesunate and artemether 5-To evaluate the progress of in vitro susceptibility to artesunate and artemether, compared with the values of in vitro susceptibility from 2005. 6-To evaluate the genotypic profile, genetic polymorphisms in pfcrt, pfmdr1 and pfATPase6 genes and copy number of the pfmdr1 gene, using as reference the results of a study conducted in 2005. The results of this project will contribute for a better control of malaria, mainly in the context of resistance, meeting the objectives of the World Health Organization in the fight against ACTs resistance.