Low doses of ionizing radiation induce angiogenesis after radiotherapy

Abstract

Radiotherapy is widely used to treat human malignant tumors, characterized by uncontrolled growth, capacity to invade adjacent tissues and produce distant metastasis. The goal of radiotherapy is to reduce or eliminate the primary tumor and its metastasis. However, ionizing radiation also alters the tumor microenvironment. While there is evidence that these changes might contribute to the anti-tumor effects of radiotherapy, it was demonstrated that the irradiated stroma might exert tumor-promoting effects. Therefore, a careful analysis of the putative pro-metastatic effect of radiotherapy is imperative as radiotherapy is an essential part of cancer treatment. Furthermore, during radiotherapy not only the tumoral target volume is irradiated but also the peritumoral tissues are exposed to low doses of ionizing radiation (LDIR). The biological effects of these LDIR on the peritumoral tissues remain to be determined. In our lab it was found that LDIR enhance angiogenesis and consequently promote tumor growth and metastasis in a mechanism dependent of the activation of VEGF receptor. This work was focused in the peritumoral vasculature that is exposed to LDIR. These findings are relevant in a tumoral context, since the vascular activation in these areas may contribute to tumor re-growth and metastasis after or during radiotherapy. In this work, we are interested in validating these findings in humans, our main goal. Tissues exposed or not to LDIR from patients with rectal cancer that received neoadjuvant radiotherapy were used. Two distinct biopsies of parietal peritoneum were surgically removed 8 weeks after the end of radiotherapy: i) a specimen exposed to doses from 5 to 30% of the therapeutic dose (100%), located in the vicinity of the tumor; and ii) an unirradiated specimen that will be used as an internal calibrator for each patient. Endothelial cells (ECs) were isolated from both of these species by laser capture microdissection (LCM) microscope followed by mRNA extraction, cDNA synthesis and quantitative RT-PCR analysis. According to our results (n=16), the level of expression of several pro-angiogenic factors (VEGFR1, VEGFR2, ANGPT2, TGFB2, VWF, FGF2, PDGFC, and HGF) was significantly up-regulated in ECs exposed to LDIR when compared to nonirradiated ECs suggesting, that ECs are activated after LDIR exposure. Simultaneously, an immunohistochemistry for vWF was performed (n=14) and we found a significant increase in microvessel density in parietal peritoneum exposed to LDIR when compared to the unirradiated one. According to our results, we discussed the vascular response (activation state of ECs and microvessel density) of the oldest patients included in the study after LDIR exposure. Moreover, we discussed the data obtained between EC activation state and microvessel density suggesting that the effect of LDIR could be dynamic and temporally different in different patients. This truly translational study will surely provide novel insights into the cellular effects of low-dose IR and be of use in the improvement of the current radiation oncology protocols.

A radioterapia é usada no tratamento de tumores malignos caracterizados por um crescimento descontrolado e capacidade de invadir tecidos adjacentes e metastizar. O objectivo desta terapêutica é reduzir ou eliminar o tumor primário evitando que haja formação de metástases. Tal é conseguido pela acção da radiação ionizante nas células tumorais e também no microambiente tumoral. Contudo, há observações experimentais e clínicas que indicam que a radiação ionizante poderá promover um comportamento metastático por parte das células tumorais e que o microambiente irradiado poderá promover a tumorigénese. Assim, é importante estudar os possíveis efeitos da radiação ionizante que promovem o crescimento tumoral e metastização, uma vez que a radioterapia é essencial no tratamento do cancro. É, também, importante ter noção que durante a radioterapia não só o volume tumoral é exposto a radiação ionizante mas também os tecidos peri-tumorais são expostos a doses mais baixas de radiação ionizante. Os efeitos biológicos e moleculares destas baixas doses de radiação ionizante nos tecidos que rodeiam a área a tratar são desconhecidos. Recentemente o nosso laboratório demonstrou que baixas doses de radiação ionizante induzem angiogénese e consequentemente promovem progressão tumoral e metastização após ou durante a radioterapia. Neste trabalho, o nosso principal objectivo é de validar estes resultados em humanos. Para tal, utilizaremos tecidos expostos ou não a baixas doses de radiação ionizante de doentes com cancro do recto submetidos a radioterapia neoadjuvante. Duas biópsias distintas de peritoneu parietal foram removidas no momento da cirurgia: i) uma em que os tecidos foram expostos a doses baixas de radiação ionizante (5 a 30% da dose terapêutica), localizada na região peri-tumoral e ii) outra que corresponde a tecido não irradiado e que será usada como calibrador interno para cada doente. As células endoteliais serão isoladas destes dois tipos de biópsias por microscopia de microdissecção e captura a laser, o ARNm será extraído, o ADNc sintetizado e será efetuada uma análise por RT-PCR quantitativo. De acordo com os nossos resultados (n=16), o nível de expressão de vários factores pró-angiogénicos (VEGFR1, VEGFR2, ANGPT2, TGFB2, VWF, FGF2, PDGFC, and HGF) está significativamente aumentado nas células endoteliais expostas a baixas doses de radiação ionizante quando comparado com aquele que é encontrado em células endoteliais provenientes de tecidos não irradiados. Simultaneamente, após imunohistoquimica para vWF (n=14), verifica-se um aumento significativo da densidade microvascular no peritoneu parietal exposto a baixas doses de radiação ionizante quando comparado com peritoneu parietal não irradiado. De acordo com os nossos resultados, também discutiremos neste trabalho a resposta vascular (nível de activação endotelial e densidade microvascular) após exposição a baixas doses de radiação ionizante nos doentes mais idosos que foram incluídos no estudo. Discutiremos ainda os resultados obtidos para o mesmo doente de activação endotelial e densidade microvascular sugerindo que o efeito de baixas doses de radiação ionizante poderá ser dinâmico e temporalmente diferente para diferentes doentes. Os resultados obtidos são cruciais para revelar novos mecanismos que permitirão compreender o efeito pro-metastático de baixas doses de radiação ionizante, contribuindo para um avanço do conhecimento na área e para a optimização dos protocolos de radioterapia.