Characterization of mitochondrial function and dynamics in models of Machado-Joseph disease

Abstract

Machado-Joseph disease (MJD) is an autosomal dominant inherited neurodegenerative disease that affects 1-2 individuals per 100,000 people. It belongs to the group of polyglutamine (polyQ) expansion disorders caused an increase in the number of CAG repeats. In MJD the mutation occurs in the MJD1/ATXN3 gene that encodes the protein ataxin-3 with an abnormal polyQ expansion at the C-terminal. Neuropathologically it is characterized by selective depigmentation of the substantia nigra and atrophy of the cerebellum, pons, and medulla oblongata. Previous studies have proposed mitochondrial dysfunction as a mechanism of neurodegeneration in many diseases, including Huntington’s disease (HD), another polyQ expansion disorder; however little is known about mitochondrial bioenergetics impairment in MJD. In the present study two different MJD models were used, namely 24 week-old CMVMJD135 (MJD135) transgenic mice expressing ATXN3 with Q135 versus wild-type (WT) mice, and PC6-3 cell line expressing ATXN3 either with Q28 (control) or Q108 (mutant), in order to characterize the changes in mitochondrial function and dynamics. Firstly we analysed mitochondrial biogenesis by evaluating the levels of PGC-1 and TFAM. We observed a significant decrease in the levels of PGC-1 in Q108 cells, which was not accompanied by altered levels of TFAM in Q108. TFAM levels were also unchanged in mitochondria isolated from cerebellum and brainstem of MJD135, as compared to WT mice. When evaluating the oxygen consumption rate, mitochondria from both areas displayed decreased maximal respiration, however only cerebellar mitochondria exhibited decreased ATP production and proton leak. No differences were observed in the activity of mitochondrial complexes of both brain areas, but mitochondrial cytochrome c protein levels were significantly reduced in cerebellar mitochondria. Cerebellar mitochondria from MJD135 mice also exhibited decreased mitochondrial membrane potential associated with abnormal calcium handling. On the other hand, brainstem mitochondria exhibited decreased calcium uptake capacity, but no changes in membrane potential. Conversely, Q108 cells demonstrated decreased mitochondrial membrane potential, without major changes in mitochondrial calcium accumulation. Despite the previous results mitochondrial production of hydrogen peroxide remained unaltered in both MJD135 brain areas. When analyzing mitochondrial dynamics Q108 cells exhibited decreased levels of the fission proteins Drp1 and Fis1, whilst the levels of the fusion proteins Mfn2 and OPA1 were unchanged, suggesting more elongated mitochondria in mutant PC6-3 cells. To evaluate the possible occurrence of mitophagy in PC6-3 Q108 cells, the levels of PINK1, parkin, p62, LC3-II and the LC3-II/LC3-I ratio were also measured. We observed decreased levels of the cargo effector p62 and LC3-II, increased cytosolic levels of PINK1, as well as no changes in parkin or in autophagossome formation, indicating altered levels of macroautophagy and mitophagy-associated proteins tending towards autophagy activation. Overall mitochondrial function and dynamics was show to be differentially compromised in both models tested, namely isolated mitochondria from MJD135 transgenic mice and PC6-3 Q108 cells.

A doença de Machado-Joseph (MJD) é uma doença neurodegenerativa autossómica dominante que afeta cerca de 1 a 2 indivíduos em 100,000 habitantes. Pertence ao grupo das doenças de expansão poliglutaminica que são causadas pelo aumento do número de repetições CAG. Na MJD a mutação ocorre no gene MJD1/ATXN3 que codifica a proteína ataxina-3 com uma expansão poliglutaminica aberrante no seu C-terminal. Neuropatologicamente é caracterizada por depigmentação seletiva da substantia nigra e pela atrofia do cerebelo, pons e medula oblongata. Estudos anteriores propuseram a disfunção mitocondrial como um mecanismo de neurodegeneração em várias doenças, incluindo a doença de Huntington (HD), uma outra doença poliglutaminica; no entanto, muito pouco se sabe sobre o dano bioenergética mitocondrial na MJD. No presente estudo dois modelos diferentes de MJD foram utilizados, nomeadamente murganhos de 24 semanas de idade CMVMJD135 (MJD135) transgénicos que expressam ATXN3 com Q135 versus murganhos wild-type (WT), e uma linha celular PC6-3 que expressa ATXN3 ou com Q28 (controlo) ou com Q108 (mutante), de modo a caracterizar as alterações na função e dinâmica mitocondrial. Em primeiro lugar, foi analisado a biogénese mitocondrial através da avaliação dos níveis de PGC-1 e TFAM. Foi possível observar uma diminuição significativa nos níveis de PGC-1 nas células Q108 que não foi acompanhada de alterações nos níveis de TFAM nas células Q108. Os níveis de TFAM mantiveram-se inalterados nas mitocôndrias isoladas do cerebelo e do tronco cerebral dos murganhos MJD135 quando comparadas com os murganhos WT. Quando se avaliou o consumo de oxigénio, as mitocôndrias de ambas as áreas demonstraram uma diminuição na respiração máxima, no entanto, apenas as mitocôndrias de cerebelo exibiram uma diminuição na produção de ATP e na fuga de protões. Não foram observadas diferenças nas atividades dos complexos mitocondriais, mas os níveis mitocondriais de citocromo c encontravam-se significativamente reduzidos nas mitocôndrias do cerebelo. As mitocôndrias do cerebelo de murganhos MJD135 também exibiram uma diminuição no potencial da membrana mitocondrial associado com uma aberrante capacidade de captar cálcio. Pelo contrário, as mitocôndrias do tronco cerebral apresentaram um decréscimo na capacidade de reter cálcio, mas não apresentaram alterações no potencial da membrana mitocondrial. Reciprocamente, as células Q108 demonstraram diminuído potencial da membrana mitocondrial sem demonstrarem alterações na capacidade de acumularem cálcio. Apesar dos resultados anteriores, a produção mitocondrial de peróxido de hidrogénio manteve-se inalterada em ambas as áreas cerebrais dos murganhos MJD135. Quando se realizou a análise da dinâmica mitocondrial, as células Q108 exibiram níveis diminuídos das proteínas de fissão Drp1 e Fis1, enquanto os níveis das proteínas de fusão Mfn2 e OPA1 se mantiveram inalterados, o que sugere que as mitocôndrias das células PC6-3 mutantes sejam mais alongadas. De modo a avaliar a ocorrência de mitofagia nas células PC6-3 Q108, os níveis de PINK1, parkin, p62, LC3-II e o rácio LC3- II/LC3-I também foram analisados. Foi possível observar a diminuição dos níveis de p62 e LC3-II, o aumento dos níveis citosólicos de PINK1 e, também, não se observaram diferenças em relação à parkin ou na formação de autofagossomas, o que indica níveis alterados de macroautofagia e de proteínas associadas com a mitofagia, indicando uma ativação da autofagia. Em geral, a função e a dinâmica mitocondrial estavam comprometidas em ambos os modelos testados, nomeadamente, Nas mitocôndrias isoladas dos murganhos transgénicos MJD135 e nas células PC6-3 Q108.