Potencial terapêutico do sirolimus e da metformina em células de leucemia linfoblástica aguda

Abstract

A Leucemia Linfoblástica Aguda (LLA) é a neoplasia hematológica mais frequente em crianças e pode afetar a linhagem B ou T de linfócitos, caracterizando-se pelo bloqueio da diferenciação e excessiva proliferação de linfoblastos com deficiente produção de células hematopoiéticas. A LLA tem origem, maioritariamente, na ocorrência de alterações cromossómicas sendo as translocações que envolvem o gene MLL as mais frequentes em crianças com idade inferior a um ano e associadas a um prognóstico desfavorável. Apesar do evento inicial ser uma destas alterações, o estabelecimento do quadro da doença dá-se devido a mutações secundárias em recetores ou outras proteínas com consequente desregulação de vias de sinalização intracelulares que contribuem para a continuidade da proliferação das células leucémicas. Apesar do tratamento da LLA nos últimos anos ter melhorado significativamente os níveis de sobrevivência dos doentes, as percentagens de recaída e de insucesso obrigam ainda à procura de alternativas terapêuticas. Torna-se necessário conhecer as alterações citogenéticas e as vias desreguladas de forma a direcionar os fármacos e criar novas estratégias terapêuticas mais eficazes. Uma das vias frequentemente alteradas em células de LLA é a via de sinalização do mTOR, o regulador central de processos como o crescimento, proliferação e sobrevivência das células. Um outro processo associado à atividade do mTOR é a autofagia que tem sido estudada como possível mecanismo de morte, apesar de em alguns tipos de tumores estar assciada à resistência das células neoplásicas ao tratamento. Assim, a inibição da atividade do mTOR e a estimulação da autofagia por ativação de outros alvos como a AMPK, podem ser sinergicamente eficazes na eliminação das células de LLA. Deste modo, o objetivo deste trabalho foi avaliar o potencial terapêutico da associação entre um inibidor do mTOR (Sirolimus) e de um ativador da AMPK (Metformina), em monoterapia e combinação terapêutica, num modelo in vitro de LLA de células precursoras B com a translocação t(11;19)(q23;p13) que origina a proteína de fusão MLL-ENL. As células foram incubadas na ausência e na presença do Sirolimus em concentrações entre 250 nM e 15 μM, da Metformina em concentrações entre 1 mM e 7,5 mM e do Sirolimus associado à Metformina nas concentrações de 250 nM e 1 mM, respectivamente. Com recurso ao teste de exclusão do azul de tripano avaliou-se os efeitos citotóxicos e citostáticos dos dois fármacos isoladamente e em associação. A administração fracionada do Sirolimus permitiu ainda avaliar a influência do esquema de administração deste fármaco. A morte celular foi avaliada por microscopia ótica, após coloração de esfregaços usando o método de May-Grünwald-Giemsa, e por Citometria de Fluxo (CF), através da dupla marcação com Anexina V e Iodeto de Propídeo. Foi também avaliada por CF a activação de caspases utilizando a sonda Apostat, o potencial de membrana com o JC-1, bem como o ciclo celular com recurso ao Iodeto de Propídeo/RNase. De forma a verificar se os fármacos induziam autofagia foi analisada por CF a expressão de LC3B, um marcador do processo autofágico. Os resultados mostram que o Sirolimus reduz a viabilidade e a proliferação celular de uma forma dependente do tempo e da dose. O IC50 do fármaco foi obtido após 48h de exposição sendo entre 7,5 μM e 10 μM. Além disso, os resultados sugerem que a administração diária do fármaco é mais eficaz na redução da viabilidade e da proliferação celular quando comparado com mesma dose total em administração única. O Sirolimus mostrou induzir morte celular por apoptose com ativação de caspases associada à despolarização da membrana. A análise do ciclo celular confirma a atividade anti-proliferativa do fármaco, uma vez que é observado um bloqueio na fase G0/G1. Também se verificou um aumento da LC3B dependente da dose que pode estar associado à morte celular. Por sua vez, a Metformina mostrou também induzir uma redução da viabilidade e da proliferação celular. O IC50 deste fármaco foi obtido mais tardiamente, às 72h de exposição, e está entre 2,5 mM e 5 mM. A morte celular induzida pela Metformina foi sobretudo por apoptose com activação de caspases associada também à despolarização da membrana. A exposição à Metformina levou igualmente a um aumento da expressão da LC3B dependente da dose que pode estar associado à morte celular. Seria expectável que a associação entre o Sirolimus e a Metformina intensificasse a atividade demonstrada por cada um dos fármacos individualmente especialmente em relação ao aumento da autofagia. No entanto, esta combinação não potenciou os seus efeitos. Futuramente seria importante uma avaliação mais profunda dos mecanismos subjacentes à ação do Sirolimus e da Metformina em associação, testar novos esquemas de administração e ainda novas doses dos fármacos.

Acute Lymphoblastic Leukemia (ALL) is the most common type of cancer in children and affects B or T lymphocyte lineage. It’s characterized by the excessive proliferation of lymphoblasts and impaired hematopoietic cell production. ALL occurrence is mainly due to chromosomal alterations and MLL gene translocations are frequently in children less than one year of age associated to an unfavorable prognosis. Although the initial event is based on these changes, the leukemia establishment occurs due to secondary changes in receptor or other proteins with consequent disruption of intracellular signaling pathways that contribute to a sustained proliferation of leukemic cells. Although treatment of ALL has significantly improved survival levels in recent years, relapse rates and failure of therapy still require new therapeutic agents. It’s necessary to know the cytogenetic changes and pathways deregulated in leukemic cells in order to direct drug targeting and create new and more effective therapeutic strategies. One pathway usually altered in ALL cells is the mTOR signaling pathway, the central controller processes such as growth, proliferation and cell survival. Another process associated with mTOR activity is autophagy and it has been studied as a possible mechanism of tumor cell death although in some types of tumors this process contributes to treatment resistance. Thus, inhibition of mTOR activity and autophagy stimulation through activation of targets like AMPK may be synergistically effective elimination of ALL cells. Thus, the main goal of this study was to evaluate the therapeutic potential of association between a mTOR inhibitor (Sirolimus) and an AMPK activator (Metformin) as adjuvant in in vitro models of B precursor cells ALL with the translocation t (11; 19) (q23; p13) and MLL-ENL fusion protein. The cells were incubated in the absence and presence of Sirolimus at a range of concentrations between 250 nM and 15 μM, Metformin at concentrations between 1 mM and 7,5 mM and Sirolimus associated with Metformin at concentrations of 250 nM and 1 mM, respectively. Using the trypan blue exclusion test was possible to construct dose-response curves that allowed the evaluation of cytotoxic and cytostatic effects of that two agents individually and combinated. The administration of Sirolimus in a fractionated wayallowed us to evaluate the influence of dose schedule on these cells. Cell death was assessed by optical microscopy after May-Grünwald-Giemsa staining and by flow cytometry Annexin V and Propidium Iodide double staining. Also by flow cytometry was measured caspase using the Apostat probe, membrane potential with JC-1 as well as cell cycle through the use of propidium iodide/RNase. In order to verify the autophagy induction it was analyzed LC3B expression, an autophagic marker, with the same technique previously resfered. The results show that Sirolimus reduced cell viability and proliferation of a time and dose-dependent manner. The drug IC50 was obtained after 48 hours of exposure and it’s a value between 7,5 μM and 10 μM. Furthermore, the results suggest a more effective daily administration of the drug with a greater reduction of cell viability and proliferation compared to the same total dose in a single administration. Sirolimus shown to induce cell death through apoptosis with caspase activation associated to mitochondrial membrane depolarization. The cell cycle analysis confirmed the antiproliferative activity of drug, since it is observed a G0 / G1 phase block. There was also an increase of LC3 in a dose dependent manner which can be associated to cell death. In turn, Metformin has also been shown to induce a reduction in viability and cell proliferation. The drug IC50 was obtained later than Sirolimus IC50, close to the 72 hours of exposure, and its value is between 2,5 mM and 5 mM. Metformin induces mainly apoptotic cell death with caspase activation also associated with membrane depolarization. However, cell cycle analysis isn’t conclusive. Metformin exposure has also led to a LC3 expression increase depending of dose which may can be related to cell death. It would be expected that Sirolimus and Metformin association produced an activity improvement relatively to drugs effects individually, especially in autophagy induction. However, this combination did not showed to potentiate their effects. In future it would be important a further evaluation of Sirolimus and Metformin underlying mechanisms of action and test several administration schedules and new drug dosages.