Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10316/34611
Title: Light-triggerable nanomaterials for the delivery of biomolecules
Authors: Lino, Miguel Maria da Fonseca Miranda Ferreira 
Orientador: Ferreira, Lino
Carvalho, Rui
Keywords: gold nanoparticles; light-triggerable materials; near-infrared; protein delivery; microRNA delivery; modulation of cell activity; nanopartículas de ouro; infravermelho próximo; entrega de proteínas; entrega de microRNAs; modelação da atividade celular
Issue Date: 20-Jun-2017
Citation: LINO, Miguel Maria da Fonseca Miranda Ferreira - Light-triggerable nanomaterials for the delivery of biomolecules. Coimbra : [s.n.], 2017. Tese de doutoramento. Disponível na WWW: http://hdl.handle.net/10316/34611
Project: info:eu-repo/grantAgreement/FCT/SFRH/SFRH/BD/81705/2011/PT 
Abstract: During the last years, proteins and microRNAs have received increased attention in the context of drug delivery, due to their modulatory effect on cellular behaviour. Moreover, the drug delivery paradigm is shifting towards combinatorial therapies for enhanced efficacy through synergistic effect between drugs. The success of multidrug delivery depends significantly on the control of drug ratios and on temporal and spatial coordination of drug delivery. This has triggered the development of new nanocarriers for immobilization of more than one drug with controllable stoichiometry and with controllable release profiles for spatio-temporal resolution on drug delivery. Nevertheless, the delivery of multiple proteins or microRNAs in an orchestrated manner remains elusive. The main objective of this thesis was to develop a near-infrared light-triggerable nanocarrier for intracellular delivery of multiple proteins and microRNAs with spatio-temporal precision. We developed a nanocarrier constituted by a gold nanorod (AuNR) conjugated with controllable amounts of single stranded DNA (ssDNA) that function as linkers for the immobilization of ssDNA-conjugated proteins or microRNAs through DNA hybridization. ssDNAs with distinct nucleotide sequences and melting temperatures were designed for highly specific hybridization and for non-overlapping release profiles. AuNRs with an aspect ratio of 3.4 and a surface localized plasmon resonance band centred at 780 nm are able to generate a photothermal effect when irradiated with a 780 nm laser. Harnessing this effect, it was possible to cause dehybridization of DNA strands and achieve distinct release profiles for each protein or microRNA. The nanoformulation was used for intracellular release of beta-galactosidase (β-Gal) and two fluorescent proteins sequentially. When irradiated, AuNRs and proteins were able to escape the endosome with low cytotoxic effect. Importantly, β-Gal remained active after being released. In this thesis, the same immobilization strategy and delivery principle were applied to the intracellular delivery of microRNAs with distinct properties for modulation of cell activity in the context of angiogenesis. miR-155 was used to enhance survival of outgrowth endothelial cells (OECs) in hypoxic conditions and miR-302a was used to induce cell proliferation. To potentiate the biological effect of miRNAs we used an antimicrobial peptide to enhance endosomal escape and uptake, increasing 63-fold the amount of gold internalized by cells. The sequential release was validated in HEK-293T reporter cell line expressing two fluorescent proteins. The first laser stimulus (2 min at 1.25 Wcm-2) was able to release miR-155 causing knockdown of one of the proteins. A higher energy stimulus (2 min at 2 Wcm-2) releases miR-302a that induces knockdown of the other protein. In OECs, release of miR-155 was able to induce more than 6-fold increase in cell survival. With higher energy stimulus, proliferation of OECs was induced by miR-302a. RESUMO: Nos últimos anos, proteínas e pequenos RNAs não codificantes (microRNAs), têm recebido maior atenção no contexto de entrega de fármacos, devido ao seu efeito de modelação do comportamento celular. Além disso, o paradigma de entrega de fármacos sofreu uma mudança no sentido de combinar terapias para uma maior eficácia através de efeitos sinérgicos entre fármacos. O sucesso da entrega de múltiplos fármacos depende bastante do controlo do rácio das moléculas e da coordenação temporal e espacial da sua entrega. Isto tem impulsionado o desenvolvimento de nanopartículas para imobilização de mais do que uma molécula com estequiometria e perfis de libertação controláveis para uma maior resolução espacial e temporal na entrega de fármacos. Contudo, a entrega de múltiplas proteínas ou múltiplos microRNAs de uma forma orquestrada ainda é ilusória. O principal objectivo desta tese foi o desenvolvimento de uma nanopartícula ativada pela luz para entrega intracelular de múltiplas proteínas e microRNAs com precisão temporal e espacial. Nós desenvolvemos uma nanopartícula constituída por um nanorod (nanopartícula em forma de bastonete) de ouro (AuNR) conjugado com quantidades controláveis de cadeias simples de DNA (ssDNA) que funcionam como ligantes, para a imobilização através de hibridização de proteínas ou microRNAs conjugados a cadeias de DNA. Foram desenhadas cadeias de DNA com diferentes sequências e temperaturas de desnaturação para se obter hibridizações muito específicas e perfis de libertação não sobrepostos. AuNR, com um rácio entre comprimento e largura equivalente a 3.4 e uma banda de ressonância plasmónica superficial centrada a 780 nm, são capazes de gerar um efeito foto-térmico quando irradiados com um laser de 780 nm. Aproveitando este efeito, foi possível causar desnaturação das cadeias de DNA e atingir perfis de libertação distintos para cada proteína e microRNA. A formulação foi usada para a libertação intracelular de beta-galactosidase e de duas proteínas fluorescentes de forma sequencial. Quando irradiados, os AuNRs escapam aos endossomas sem induzir efeito citotóxico. A enzima beta-galactosidase permanace activa após libertação. Nesta tese, a mesma estratégia de imobilização e princípio de entrega foram aplicados à entrega de microRNAs com diferentes propriedades para modelação da atividade celular no contexto de angiogénese. O MicroRNA-155 (miR- 155) foi utilizado para aumentar a sobrevivência de um tipo de células endoteliais progenitoras (outgrowth endothelial cells – OECs) em condições de hipoxia e o miR-302a foi usado para induzir proliferação celular. Para potenciar o efeito biológico dos microRNAs, nós usámos um péptido antimicrobiano para aumentar o escape aos endosomas e a internalização, tendo conseguido aumentar em 63 vezes a quantidade de ouro internalizada pelas células. A libertação sequencial de microRNAs foi validada em células repórter HEK- 293T que expressam duas proteínas fluorescentes. O primeiro estímulo com laser (2 min a x 1.25 Wcm-2) induziu a libertação do miR-155, causando a diminuição da expressão de uma das proteínas. Um estímulo de maior energia causa a libertação de miR-302a e leva à diminuição da expressão da outra proteína. Em células OEC, a libertação de miR-155 aumentou em mais de 6 vezes a sobrevivência das células. Com um estímulo de maior energia, a proliferação de OECs foi induzida pela libertação de miR-302a.
Nos últimos anos, proteínas e pequenos RNAs não codificantes (microRNAs), têm recebido maior atenção no contexto de entrega de fármacos, devido ao seu efeito de modelação do comportamento celular. Além disso, o paradigma de entrega de fármacos sofreu uma mudança no sentido de combinar terapias para uma maior eficácia através de efeitos sinérgicos entre fármacos. O sucesso da entrega de múltiplos fármacos depende bastante do controlo do rácio das moléculas e da coordenação temporal e espacial da sua entrega. Isto tem impulsionado o desenvolvimento de nanopartículas para imobilização de mais do que uma molécula com estequiometria e perfis de libertação controláveis para uma maior resolução espacial e temporal na entrega de fármacos. Contudo, a entrega de múltiplas proteínas ou múltiplos microRNAs de uma forma orquestrada ainda é ilusória. O principal objectivo desta tese foi o desenvolvimento de uma nanopartícula ativada pela luz para entrega intracelular de múltiplas proteínas e microRNAs com precisão temporal e espacial. Nós desenvolvemos uma nanopartícula constituída por um nanorod (nanopartícula em forma de bastonete) de ouro (AuNR) conjugado com quantidades controláveis de cadeias simples de DNA (ssDNA) que funcionam como ligantes, para a imobilização através de hibridização de proteínas ou microRNAs conjugados a cadeias de DNA. Foram desenhadas cadeias de DNA com diferentes sequências e temperaturas de desnaturação para se obter hibridizações muito específicas e perfis de libertação não sobrepostos. AuNR, com um rácio entre comprimento e largura equivalente a 3.4 e uma banda de ressonância plasmónica superficial centrada a 780 nm, são capazes de gerar um efeito foto-térmico quando irradiados com um laser de 780 nm. Aproveitando este efeito, foi possível causar desnaturação das cadeias de DNA e atingir perfis de libertação distintos para cada proteína e microRNA. A formulação foi usada para a libertação intracelular de beta-galactosidase e de duas proteínas fluorescentes de forma sequencial. Quando irradiados, os AuNRs escapam aos endossomas sem induzir efeito citotóxico. A enzima beta-galactosidase permanace activa após libertação. Nesta tese, a mesma estratégia de imobilização e princípio de entrega foram aplicados à entrega de microRNAs com diferentes propriedades para modelação da atividade celular no contexto de angiogénese. O MicroRNA-155 (miR- 155) foi utilizado para aumentar a sobrevivência de um tipo de células endoteliais progenitoras (outgrowth endothelial cells – OECs) em condições de hipoxia e o miR-302a foi usado para induzir proliferação celular. Para potenciar o efeito biológico dos microRNAs, nós usámos um péptido antimicrobiano para aumentar o escape aos endosomas e a internalização, tendo conseguido aumentar em 63 vezes a quantidade de ouro internalizada pelas células. A libertação sequencial de microRNAs foi validada em células repórter HEK- 293T que expressam duas proteínas fluorescentes. O primeiro estímulo com laser (2 min a
Description: Tese de doutoramento em Biociências, na especialidade de Biotecnologia, apresentada ao Departamento de Ciências da Vida da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra
URI: http://hdl.handle.net/10316/34611
Rights: embargoedAccess
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