MITODREADDs: a tool to study G-protein signaling in mitochondrial trafficking

Abstract

G-protein coupled receptors (GPCRs) are widely expressed throughout the brain, regulating a vast array of functions such as cognition, pain and synaptic transmission. The cannabinoid type1 receptor (CB1R), the most abundant GPCR in the brain, is a powerful regulator of metabolic activity and synaptic plasticity by coupling to multiple Gα protein subunits. Interestingly, several of those Gα proteins have been located to the mitochondria. Moreover, CB1R was shown to be present at the membranes of neuronal mitochondria (mitochondrial cannabinoid receptor type 1, or mtCB1R), where it directly regulates cellular respiration and energy production. More recently, mtCB1R has been linked to the modulation of mitochondrial trafficking, which is essential for synaptic transmission and neuronal survival. To dissect the pathways involved in this process, we developed a series of new chemogenetic receptors to control Gs and Gi protein signaling in mitochondria. We dubbed it as mitochondrial Designer Receptors Exclusively Activated by a Designer Drug (mitoGi-DREADD and mitoGsDREADD), by comparison to already existent Gi-DREADD and Gs-DREADD. Previous results demonstrated that mitoGi and mitoGs-DREADD are targeted to the mitochondria through the addition of four mitochondrial leader sequences (MLS); here, we showed that mitoGs and mitoGi-DREADD display a unique signaling profile in Hela and HEK cells as a consequence of mitochondrial location. Both receptors were unable to activate the canonical GPCR-dependent extracellular regulated kinase (ERK) pathway. Furthermore, the receptors exerted a bi-directional modulation of mitochondrial respiration, with mitoGi-DREADD causing a mtCB1R-like depressing effect in respiration and mitoGs-DREADD promoting an increase. We then focused on the effect of Gi/mitoGi-DREADD on mitochondrial trafficking in neurons. However, none of the receptors was detected in hippocampal neurons. To improve this, a pIRES bicistronic vector was created to co-express the receptors with the fluorescent protein MitoDsRed, but this approach was also unsuccessful. Nevertheless, mitochondrial trafficking was assessed and we found first that mitoGi-DREADD appears to abolish mitochondrial motility per se in Hela cells, which could indicate a toxic effect on mitochondrial function. On the other hand, mitochondrial motility and velocity was within the normal parameters for neurons transfected with mitoGi and Gi-DREADD. In this regard, we showed that CNO causes a tendency for decreased mitochondrial motility in hippocampal neurons transfected with mitoGi-DREADD, but not with Gi-DREADD. Overall, we conclude that mitoDREADDs are a highly promising chemogenetic tool to control mitochondrial activity via G-protein signaling, but they still require considerable optimization to minimize deleterious effects.

Os recetores acoplados a proteínas G (GPCRs) encontram-se amplamente distribuídos no cérebro, onde regulam diversas funções como a cognição, algesia e transmissão sináptica. O principal representante desta classe no cérebro, o recetor de canabinóides tipo 1 (CB1R), é um elemento chave na regulação da atividade metabólica e plasticidade sináptica, através do acoplamento a diversas subunidades de proteínas G. Paralelamente, algumas destas proteínas G exibem localização mitocondrial. A juntar a isso, já foi demonstrado que o CB1R se encontra presente nas membranas de mitocôndrias neuronais (recetor mitocondrial de canabinóides tipo 1, ou mtCB1R), onde regula diretamente a respiração celular e a produção de energia. Recentemente, o mtCB1R foi associado à modulação do tráfego mitocondrial, um processo essencial à transmissão sináptica e sobrevivência dos neurónios. De modo a descobrir quais as vias de sinalização envolvidas neste processo, desenvolvemos um conjunto de recetores quimiogenéticos capazes de controlar a sinalização por proteínas G na mitocôndria. A estes demos o nome de recetores mitocondriais de desenhador exclusivamente ativados por fármacos de desenhador, ou mitoDREADDs . Previamente, foi revelado que os mitoDREADDs são direcionados para a mitocôndria ao promover a sua fusão com quatro sequências repetitivas de localização mitocondrial (MLS). Neste trabalho, demonstrámos que tanto o mitoGi-DREADD como o mitoGs-DREADD apresentam um perfil sinalizador único em células HEK e Hela como consequência da localização mitocondrial. Ambos os recetores foram incapazes de promover a fosforilação de ERK 1/2, uma via canónica associada aos GPCRs. Além disso, os recetores exerceram um controlo bidirecional da respiração mitocondrial, com mitoGiDREADD a causar um decréscimo da mesma, semelhante ao obtido com mtCB1, ao passo que mitoGs-DREADD estimulou a respiração. Com base nestes resultados, focámo-nos no efeito de Gi e mitoGi-DREADD no tráfego mitocondrial em neurónios do hipocampo. No entanto, não foi possível detetar nenhum dos recetores em neurónios. De forma a resolver isto, foi criado um vetor bicistrónico pIRES com o intuito de co-expressar os recetores com a proteína fluorescente MitoDsRed, mas esta estratégia falhou. Mesmo assim, procedemos à análise do transporte mitocondrial e descobrimos que mitoGi-DREADD parece eliminar por si só a mobilidade mitocondrial em células Hela, o que indica um possível efeito tóxico do recetor. Por outro lado, a mobilidade e velocidade mitocondrial encontravam-se dentro dos parâmetros normais em neurónios transfectados com mitoGi e Gi-DREADD. De um modo geral, foi possível concluir que os mitoDREADDs representam uma aplicação quimiogenética extremamente promissora para controlar sinalização por proteínas G na mitocôndria, mas é necessário otimizar consideravelmente a técnica de modo a minimizar os seus efeitos prejudiciais.