The role of NEP-TC in the somatic embryogenesis of tamarillo (Solanum betaceum)

Abstract

O tamarilho (Solanum betaceum Cav.) é uma árvore de pequeno porte da família das solanáceas, conhecido pelos seus frutos comestíveis e nutritivos. O estudo desta espécie é bastante útil na compreensão do processo de indução de embriogénese somática (ES), uma importante ferramenta para clonagem de plantas e sua propagação in vitro. Durante este processo, tanto calos embriogénicos (CE) como não-embriogénicos (CNE) surgem no mesmo explante, num meio de cultura com reguladores de crescimento vegetal (picloram ou ácido 2,4-diclorofenoxiacetico). A NEP-TC é uma proteína expressa de forma consistente em calos não-embriogénicos de tamarilho, tendo sido associada à família SpoU de metiltransferases de RNA dependentes de SAM por comparação bioinformática com sequencias homólogas presentes na planta modelo Arabidopsis thaliana. O presente estudo tem como objetivo a elucidação do papel da NEP-TC na embriogénese somática de tamarilho, mas também fazer uma caracterização extensiva desta proteína, através da realização de ensaios de atividade específica para avaliação da ação como metiltransferase da NEP-TC recombinante expressa em Escherichia coli, assim como estudos de imunohistoquímica para determinação dos locais de expressão da proteína em tecidos embriogénicos e não-embriogénicos. Foram também realizados ensaios de bioinformática para determinação da filogenia e estrutura desta proteína. Após expressão da proteína num sistema heterólogo, os resultados de atividade mostram que a NEP-TC apresenta de facto afinidade para com RNA, não apresentando taxas de atividade em relação a DNA, confirmando desta forma estudos de bioinformática realizados previamente. Analisando a afinidade da proteína relativamente a RNA ribossomal (rRNA), esta apresenta afinidade para com este substrato. Quanto àimunolocalização, a NEP-TC mostra expressão diferencial, com uma presença consistente em tecidos não embriogénicos, e uma manifestação menos distinta em tecidos embriogénicos e tecidos em diferenciação. A análise bioinformática mostra que esta proteína pertence a uma família de genes com apenas um gene que sofreu alterações ao longo do tempo, originando os 38 genes presentes na árvore.

Tamarillo (Solanum betaceum Cav.) is a small solanaceous tree known for its edible and nutritious fruits. This species is extremely useful for understanding the process of induction of somatic embryogenesis (SE), an important tool for plant cloning and in vitro propagation. During this process, both embryogenic (EC) and non-embryogenic (NEC) calli arise from the same explant, in a medium with plant growth regulators (picloram or 2,4-dichlorophenoxyacetic acid). NEP-TC (26.5 kDa) is a protein identified as being consistently present in tamarillo’s non-embryogenic calli, having been associated with the SpoU SAM-dependent RNA methyltransferase family, by bioinformatic comparison with homologous sequences found in the model plant Arabidopsis thaliana. The present study aims to elucidate the role of NEP-TC on tamarillo somatic embryogenesis, as well as perform an extensive characterization of the protein, by activity tests to evaluate the methyltransferase activity of recombinant NEP-TC expressed in Escherichia coli and immunohistochemical studies for the localization of NEP-TC on both embryogenic and non-embryogenic calli. Bioinformatic studies were also performed to determine the structure and phylogeny of this protein. After successful protein expression on a heterologous system, specific activity results show that NEP-TC has affinity towards RNA, while showing no activity rates towards DNA, thus confirming previous bioinformatic studies performed. Analyzing the protein’s affinity towards ribosomal RNA (rRNA), it is clear that the protein has affinity towards this substrate. When it comes to immunolocalization, NEP-TC shows a differential expression, with a consistent presence in peripheral areas of nonembryogenic tissues and a less distinct manifestation in embryogenic tissues and cells inthe process of differentiation. Bioinformatic analysis shows that this protein belongs to a gene family with only one gene that has been suffering alterations over time originating the 38 genes present in the genome of this tree.