Novel regulator genes controlling mesenchymal stem cell function and adipose tissue remodelling

Abstract

Maus hábitos alimentares e um estilo de vida sedentário contribuem para o aumento das taxas de obesidade em todo o mundo. A remodelação do tecido adiposo branco em resposta ao excesso crónico de energia resulta do aumento de tamanho dos adipócitos existentes (hipertrofia) e da formação de novos adipócitos através do recrutamento de células mesenquimais do estroma residentes no tecido adiposo. O aumento dos gastos energéticos pode ser conseguido através da activação da termogénese no tecido adiposo castanho e formação de adipócitos beges dentro de tecido adiposo branco (browning). Os mecanismos reguladores destes processos ainda estão muito por explorar. Sabe-se que prostaglandinas como PGI2 promovem o recrutamento e browning de células mesenquimais do estroma, e recentemente a enzima esfingosina cinase-1 (Sphk1) foi identificada como um importante regulador da activação termogénica do tecido adiposo castanho em resposta a baixas temperaturas. Sphk1 pertence à via de sinalização de esfingolípidos, e em obesidade os seus níveis encontram-se elevados, assim como o seu produto esfingosina-1-fosfato (S1P) e ceramida. Esta tese teve objectivo determinar o papel da Sphk1 no recrutamento e diferenciação de células mesenquimais do estroma, e também a sua função em adipócitos maduros. O silenciamento de Sphk1 através de siRNA em adipócitos castanhos reduziu significativamente a expressão de genes envolvidos na termogénese e resposta a estimulação por norepinefrina (NE), e reduziu também a taxa basal de lipólise, o que indica que a função de adipócitos castanhos é claramente afectada na ausência de Sphk1/S1P. Para além disso, o silenciamento de Sphk1 em adipócitos brancos e beges, induzidos por adição de cPGI2, reduziu significativamente a expressão de genes reguladores da adipogénese e lipólise, o que no entanto se traduziu num aumento da taxa de lipolise em adipócitos beges. Por outro lado, o silenciamento de Sphk1 em células progenitoras de adipócitos castanhos diminuiu significativamente a sua diferenciação, o que indica que Sphk1 é necessária para o processo de diferenciação de adipócitos castanhos. Mais ainda, o silenciamento de Sphk1 em células progenitoras do tecido adiposo branco reduziu significativamente a expressão de genes marcadores de adipogénese, em condições normais e na presença de cPGI2, o que indica que Sphk1 tem um papel semelhante na regulação da diferenciação de adipócitos brancos e beges. A expressão de genes mitocondriais também foi reduzida significativamente, o que pode comprometer a capacidade oxidativa dos adipócitos. Para além disso, o silenciamento de Sphk1 aumentou significativamente apoptose e morte celular de adipócitos durante o processo de diferenciação, medido por marcação das células com AnnexinV e detecção por citometria de fluxo. Esta técnica também permitiu detectar marcação de DNA com EdU, e revelou que há uma acumulação de células na fase S/G2/M e redução da proliferação celular na ausência de Sphk1. Ambos os resultados permitem explicar a redução na adipogénese observada nas experiencias anteriores. Por último, a adição de S1P a células progenitoras do tecido adiposo branco reduziu adipogénese e promoveu proliferação celular. Concluindo, estes resultados mostram que a sinalização de Sphk1/S1P tem um papel importante no recrutamento e diferenciação de células progenitoras de adipócitos, com especial relevância no desenvolvimento de adipócitos castanhos. Por isso é relevante continuar a explorar o papel dos esfingolípidos na regulação do tecido adiposo, dado o seu potencial para aplicações terapêuticas em doenças metabólicas.

A high calorie diet and sedentary lifestyle have led to the spiralling increase in obesity rates around the world. Remodelling of white adipose tissue (WAT) in response to chronic energy excess is accomplished by enlargement of existing adipocytes (hypertrophy) and generation of new ones by recruitment of mesenchymal stromal cells (MSC) resident in adipose depot. Increasing energy expenditure can be accomplished by activation of brown adipose tissue (BAT) thermogenesis and formation of beige adipocytes in white depots (browning). The mechanisms regulating these processes are still fairly unknown. Prostaglandins have been shown to promote MSC recruitment and browning, in particular PGI2, and recently sphingosine kinase 1 (Sphk1) was identified as an important gene in BAT thermogenic activation in response to cold exposure. Sphk1 is an enzyme of the sphingolipid pathway, and has been found upregulated in obesity along with its product sphingosine-1-phosphate and ceramide. The aim of this study was to determine the role of Sphk1 in MSC recruitment and differentiation, and also the role in mature adipocyte function. siRNA-mediated knock down of Sphk1 in brown adipocytes significantly reduced expression of thermogenic genes and norepinephrine (NE) responsiveness, and also reduced basal lipolysis, indicating a clear impairment of brown adipocyte function in the absence of Sphk1/S1P signalling. In addition, Sphk1 knock down in white and cPGI2-induced beige adipocytes markedly reduced expression of general adipogenic markers and genes regulating lipolysis, which surprisingly translated into an increase in lipolysis in beige adipocytes. On the other hand, Sphk1 knock down in brown progenitors significantly reduced differentiation, which indicates that Sphk1 is required for normal brown adipocyte differentiation. Moreover, Sphk1 knock down in undifferentiated WAT MSCs significantly reduced expression of adipogenic genes, both in normal conditions and in the presence of cPGI2, indicating that Sphk1 regulates white and beige adipogenesis in a similar way. Genes involved in mitochondrial biogenesis were also significantly reduced, which may compromise the oxidative capacity of adipocytes. Furthermore, knock down of Sphk1 significantly increased apoptosis and cell death of differentiating adipocytes, measured by increased AnnexinV staining detected by flow cytometry. Additionally, EdU labelling allowed detection of cell accumulation in S/G2/M phase and reduction in cell proliferation. Both results could explain the observed reduction in adipogenesis. Finally, in line with its known effects, S1P added to differentiating WAT MSC reduced adipogenesis and promoted cell proliferation. Overall, these results show that Sphk1/S1P signalling plays an important role in recruitment and differentiation of adipocyte progenitors, with particular relevance for brown adipocyte development. Therefore, it is relevant to further explore the role of sphingolipids in regulation of adipose tissue, with potential for therapeutic application in metabolic diseases.